Anne gen ürünlerinin işlenmesi için kullanılan zebra balığı oositlerin in vitro olgunlaşması için optimize edilmiş bir protokol burada sunulmuştur.
Hayvan embriyonik gelişimin erken safhalarında sırasında gerçekleşecek Hücresel olayların gelişmekte oosit içine yatırılır maternal gen ürünleri tarafından tahrik edilmektedir. Bu etkinlikler, genellikle yumurta içinde döllenme yani; önceden kısa bir süre sonra hareket anne ürünler dayandıklarından, döllenmiş yumurtanın içine reaktiflerin enjeksiyonunu içeren ekspresyon ve fonksiyonel indirgenmesi için standart yaklaşımlar tipik olarak etkisizdir. Bunun yerine, bu tür kullanımlar, önce ya da anne ürünlerin birikmesi sırasında, oogenezis sırasında gerçekleştirilmelidir. Bu makalede, erişkin için hayatta embriyo elde ayrıntılı olarak olgunlaşmamış zebrabalıkları oositlerin in vitro olgunlaşması ve bunların daha sonraki in vitro döllenme için bir protokol açıklamaktadır. Bu yöntem, bu tür fenotipik kurtarma ürünleri ve etiketli yapı görselleştirme ifadesi olarak Oogenezinde maternal ürünleri, fonksiyonel manipülasyonuna izin hem de birters-genetik maddeler ile gen işlevinin azaltılmasını s.
Hayvan gelişimi esnasında, yumurtanın içine ana yatakları gen ürünleri (örneğin, RNA, protein ve diğer biyomoleküllerin); bu ürünler derhal döllenme 1, 2 Aşağıdaki erken hücresel süreçleri için önemlidir. Döllenmiş yumurta 3 içine reaktiflerin enjeksiyonu için bir standart yaklaşım kullanıldığında anne ürünleri ifade ve işleminin işleme tipik olarak etkisizdir. En RNA ve proteinler oogenez sırasında oositin tarafından üretilen, yani önceden yüklenmiş anne ürünler zaten olgun yumurta mevcut olmasıdır. MOs mRNA, döllenme esnasında yumurta içinde halihazırda mevcut değildir, önceden mevcut hedef protein için bu tür önceden mevcut ürünler, örneğin Morfolino antisens oligo (MOS) gen hedefleme ajanları, fonksiyonel devirme karşı dayanıklıdır. Ayrıca birçok erken embriyonik süreçler döllenme influen edilemeyecek kadar kısa bir süre sonra gerçekleşmesiRNA, embriyojenez ilk olayları etkileme yeterince hızlı üretilmiş olmayabilir olarak, döllenmiş yumurtanın içine enjekte RNA'dan türetilen protein ürünleri ced. Aynı nedenle, erken embriyo etkin rol oynayan sırasında görüntüleme zamanında üretilmiş olmayabilir döllenmiş yumurtanın içine bir mRNA enjeksiyon yoluyla ifade edilen protein füzyonlarını etiketli. Yumurta aktivasyonundan önce ekstrüde olgun oosit içine enjeksiyon mümkündür ancak benzer teknik konuları kapsamaktadır: bu olgun yumurta zaten anne protein ile önceden yüklenmiş ve bunlar yumurta sonrasına kadar (yani eksojen transkript proteini üretmek için) translasyonel olarak aktif olmazlar aktivasyonu. Bu nedenlerle, embriyojenezin ilk safhalarında hareket anne gen ürünlerinin işleme tipik olarak olgunlaşma oosit oogenezisin sırasında gerçekleştirilebilir gerekmektedir.
Solüsyonu ° olgunlaşması için izin nitro olgunlaşma yöntemleri, bu engellerin üstesinden bir yaklaşım olarak,ytes evre IV yumurta oluşumuna, zebra balığı kurulmuştur. Erken yöntemler in vitro olgunlaşma olarak izin verilir, ancak ortaya çıkan olgun yumurta döllenme 4 yetkili değildi. Daha sonra in vitro olgunlaşması 7, 8 sonra güvenilir in vitro fertilizasyon (IVF) için izin verilen balık türleri 5, 6 bulunan ovaryan sıvının alkalin pH, taklit pH 9.0'a nötr kültür koşulları manipülasyonu. Gerçekten de, in vitro -matured oositler 3, 8 verimli olan yetişkinliğe hayatta ve embriyo verebilir. Bu geliştirilmiş yöntem olup, ayrıca mat olarak yıkmak fonksiyonel aracılı MO anne genlerin fonksiyonel manipülasyon ekzojen sentezlenmesiyle zebra balığı oogenez sırasında etiketli proteinlerin ekspresyonunu ve ihtiva etmek üzere adapte edilmişuring evre IV oositler 3 (Şekil 1).
Balığı oogenez olgun oosit 9 (Oogenezinde çeşitli aşamalarına hızlı bir kılavuz için Tablo 1 'e bakınız) oluşumuna yol açan karakteristik bir dizi aşamadan sergiler. Kısaca, oosit gelişimi evre I oositler tarafından başlatılır ve mayoz profaz I diploten aşamasında tutuklandı. Oositler, (aynı zamanda evre II sırasında başlatılan kortikal granüller olarak da bilinir) kortikal alveollerin oluşumu (aşamaları IA ve IB sırasında başlatılan) aktif transkripsiyon yoluyla büyüme ve vitellogenez (evre III sırasında başlatılan) tabi tutulur. Oosit büyüme ı devam ettiğinde mayoz, oosit çekirdeğinin sökme sonuçlanan torbacığı (GV) olarak ifade evre IV sırasında tamamlanır. Daha sonra, mayoz metafaz II tekrar tutuklandı. Evre IV sırasında, oosit gelişimi ve mayoz arrest tamamlanması olgun evre V, örneğin yol açar9 g. Foliküler membran uzaklaştırılması yumurtalık 10 lümenine oositin açığa çıkmasıyla ve döllenme ve uygun yumurta aktivasyonu için gereklidir. Yumurta doğal çiftleşme sırasında anneden kalıptan edildikten sonra, aktif hale gelir. Zebrabalıkları olarak, suya maruz kalma bağımsız sperm 11 varlığı nedeniyle, tam yumurta aktivasyon için yeterlidir.
İn vitro koşullarda nedeniyle şu anda birikimine büyüklüklerine (690-730 um), asimetrik bir pozisyonda geniş bir GV varlığında ve tamamen opak bir görünüm tarafından kabul edilebilir IV erken aşamada oositlerin olgunlaşması için izin tam demonte GV protein işleme 12 (Şekil 2C) sarısı nedeniyle saydam bir görünüm ile karakterize edilen, olgun evre V yumurta sarısı -to proteinleri (Şekil 2B). Bu yaklaşımda, bütün yumurtalık devamgelişimin farklı aşamalarında Aining oosit kadınlarda kaldırılır. Oositler 17α-20β-dihidroksi-4 pregnen-3-on (DHP), etkili bir olgunlaşma indükleyici hormon 8 gelişmelerine izin verilmiştir. Bu süre boyunca, olgunlaşan oosit ekspresyon enjeksiyon (örneğin kapatılmış, in vitro -transcribed mRNA) ya da ters genetik maddeler (örneğin, ay) manipüle edilebilir. foliküler tabaka kendiliğinden olgunlaşma döneminin sonuna doğru dökmez, bu nedenle elle kaldırılmalıdır. Defolliculation sonra, in vitro fertilizasyon (embriyonik (E3) bir ortam içinde mevcut olan), su 13 yumurta maruziyeti ve sperm çözelti içinden yumurta aktivasyonunu tetiklenmesi ile elde edilir. Elde edilen zigotlar embriyo gelişimini geçmesi ve (anne gen işlevini değiştirmek için tedavilerin yeteneğinin değerlendirilmesi için ve görselleştirme ve etiketli anne ürünlerin analizi için izin <strong> Şekil 3).
Yukarıdaki protokol böylece erken zebra balığı embriyo maternal gen ürünlerinin çalışması için izin Fertilizasyondan önce gen ürünlerinin işlenmesi için olan. Daha önce yapılan çalışmalar vitro 4'te oosit olgunlaşması mümkün olmuştur; Bu protokol, oositler 8 olgunlaşmış in vitro daha sonra döllenmesi amacıyla izin vermek için modifiye edilmiştir. Bu da, embriyonun erken dönemine 3'te anne tarafından miras kalan ürünlerin fonksiyonel manipülasyon ve görselleştirme için reaktifler enjeksiyonuna olanak tanır. Bu yöntemle elde edilen embriyolar yaşayabilir olabilir ve bereketli yetişkin olmayı yaşayabilir. Sağlıklı, bereketli yetişkin (yayınlanmamış gözlemler) haline yaklaşık yarısı bu aşamada en yüzme kesesi enflasyonu ile değerlendirilen ön deneylerde, bu prosedürün türetilmiş döllenmiş embriyo yaklaşık yarısı, geliştirme 5. gününde yaşayabilir idi.
vardırkritik adımlar protokolde dikkate almak. uygun bir aşamada Oositler dişi son şeklindeki olup olmadığını zenginleştirilebilir olgunlaşmasını (erken evre IV) başlatır, ancak önce 8 DPP için. Son zamanlarda çiftleşmemiş olması balık kullanma olgunlaşma uğramayacağını yumurta 14 yozlaşan neden olabilir. Az 8 gün içinde çiftleşen dişiler evre III veya daha az yumurta çoğunluğu sağlayarak ve böylece, yumurta in vitro düzgün olgun olmayacaktır. 8 gün önce şeklindeki kadınlarda Yumurtalıkların erken evre IV oosit optimal fraksiyonu olacaktır. Bunlar opaklık ve dış merkezli bir konumda (Şekil 2B) GV mevcudiyeti ile fark edilebilir. Oosit, bir mikroskop altında kademeli bir mikrometre slayta yerleştirildi ve standart hazırlama kılavuzlar (Tablo 1) ile karşılaştırıldığında ile Oosit aşaması belirlenmesi de, boyut ölçümü ile destekli olabilir. Ancak, erken evre IV oositlerin yakın maksimal boyutu olgun kıyasla sahip(göreli şeffaflık ve GV eksikliği tarafından tanınan; Şekil 2C) oositleri, genel olarak doğrudan oosit boyutu ölçüm ihtiyacını ortadan kaldırır, yukarıda tarif edildiği gibi ve kolay bir şekilde, kabul edilmektedir.
In vitro olgunlaşması dişi oosit donör ortama alıştırılır kaldığı gün ışığı döngüsü sonuna birkaç saat içinde başlaması gerekir. Oositler ışık döngüsünün sabah döneminde kültürlendirilmiş, kötü fertilizasyon oranlarında yansıyan, düzgün olgun olmayacaktır. In vitro oosit olgunlaştırma yöntemi sirkadiyen bağımlılık sebebi anlaşılacaktır ancak büyük olasılıkla oogenez 21 sırasında devir daim gen ekspresyonunu içeren, in vivo yumurta olgunlaşması altta yatan sirkadiyen sapmaları gösterir değildir. Uygun oosit evreleme rağmen, in vitro olgunlaşması başarılı geçmesi için başarısız oositler için yaygın bir nedeni, DHP süresi olmasıdır. DHP hormonu genellikle bir yıl sonra sona eriyor ve etkisini sigortaive olgunlaşma, işçi toplu kullanımda 9 ay içinde değiştirilmelidir.
yöntemin amacı anne ürünlerin fonksiyonel manipülasyon olduğunda oositlerin enjeksiyon başka önemli bir adımdır. Bu prosedür, 0-30 MPF'e döllenmiş yumurta standart enjeksiyonlar için farklılık gereksinimleri vardır. Oosit enjeksiyon önemli bir faktör, örneğin Leibovitz L-15 ortamına 22, 23 olduğu gibi, erken yumurta aktivasyonuna yol açmayan koşullar altında enjekte gerçekleştirmek için ihtiyaç vardır. onlar yumurtalıkların gömülü olduğundan, olgunlaşan oositlerin da enjeksiyon bazı özel zorluklarla. Protokol Yukarıdaki ilk yumurtalık oosit ayrışan ve daha sonra enjekte ederken her bir forseps ile ayrı ayrı oosit ayrışmış tutma göstermektedir. Bu teknik, minimum tutma ile uygun bir aşamada ön ayırma oosit iyi çalıştı ve olanak sağlamaktadır. Alternatif yöntemler de kullanılabilir, örneğini) standart enjeksiyon halinde yerleştirilmesi oositler agaroz, in vitro bir matürasyon ortamında muhafaza ederken bu alternatif yöntemde çukur destek enjeksiyonu sırasında, oosit dikey duvarlarının (oositler enjeksiyon plakalara transfer gereken 15) ve ii oluklara: olarak ) oositler, oositler, her iki için enjeksiyondan sonra ayrışmış gerekmektedir Bu yaklaşımda enjekte oosit ile temas (önlemek için enjeksiyon sırasında forseps ile tutulabilir yumurtalık kütle, bağlı DHP kalmasını kolaylaştıracak kalması ve defolliculation izin vermek için izin kendisi IVF için gerekli). Bu aşamada koryonik membranı tamamen 9 gelişmiş değildir, çünkü bu özel sorun olmasına rağmen, evre IV oositleri kolaylıkla bir enjeksiyon iğnesi ile muhtemelen nüfuz edilebilir.
Mevcut olgunlaşma protokolünün bir sınırlama in vitro olgunlaşması koşullarında uygun oosit gelişimi teşvik bu yanioosit olgunlaştırma aşaması IV daha erken aşamalarda başlatıldığında oluşturulamaz. Oositler bunlar (340 ila-690-mikron aralığına karşılık gelen vitellogenez) evre III sırasında ortaya 520 um bir çapa, ulaştıklarında olgunlaşmasını geçerek DHP yanıt hakim olmak 9. Bununla birlikte, döllenme 3 yetkili olmayan oositlerde evre III oosit sonuç kültürü. Ürünü sadece in vitro kültür aşaması IV (Şekil 2B) başlatılır, olgun, evre V oosit (Şekil 2C ve D) dönüşebilir oosit. Bu evre III vitellogenez ve oosit gelişimi 9 için gerekli olmasından ile ilişkili olabilir. Bu nedenle, bu yazıda, in vitro oosit olgunlaştırma işlemi sadece IV oosit (B) ve en erken aşamalarında oosit (etaplı bir tablanın bir başlangıç popülasyonu ile kullanılmalıdır – III; Figür E <strong> 2A). Aynı nedenle, bu prosedür aşaması IV ya da daha az ifade edilen genlerin sınırlıdır. Ürünler daha önce ifade edilen genlerin işlevsel manipülasyonu yerine genetik yöntemlerde (aşağıya bakınız) dayanmak zorunda olabilir. In vitro kültür olgunlaşma yöntemlerine İyileştirmeler gelecekte bu nedenle in vitro olgunlaşma yaklaşımın gücünü genişleterek, daha erken aşamalarda oosit Kulturlemenin başlatılması için izin verebilir.
Yöntemin bir başka sınırlama gübreleme dahil sonraki aşamalar için gerekli olduğunu defolliculation şu anda, prosedürde hız sınırlayıcı bir adımdır olup. foliküler membran Gelişen oositi çevreleyen şeffaf bir katman, ve kaldırma sıkıcı olabilir. Bu zar tam kaldırılmazsa, yumurta tam etkinleştirilmiş ve döllenmiş olmaz. Bu genişletmek için koryon yetmezliği ve düzensiz yerleştirilmiş, karık benzeri st gelişimi ile belirgin yapılırdöllenmemiş embriyoların 11 karakteristik sı (pseudocleavages). Xenopus kullanılan kolajenaz gibi enzimatik defolliculation yöntemleri, denenmiştir. Ancak, bizim elimizde, bu teknik başarılı olmamıştır, ve bu yüzden manuel defolliculation güveniyor. Manuel defolliculation emek yoğun ve zaman alıcı olduğundan, in vitro oosit olgunlaşması sonra döllenmiş yumurtaların büyük gruplar elde etmek zordur. Nedeniyle manuel defolliculation dayattığı zamansal sınırlama, şu anda 5-10 yumurta küçük gruplar halinde, bir seferde birkaç defolike, olgun yumurtaları döller. Bu prosedür ile enzimatik defolliculation dahil edilmesi olası önemli ölçüde verim ve genel kullanım kolaylığını arttırır.
In vitro -matured fertilizasyonu sonra üretilen embriyolar canlı yetişkinler olmakta, ancak biz IVF sonrası, embriyoların bir kısmı bunu unutmayın Normalde ya zamanında bölmek değil. Biz şu anda, yayılma bu yöntemle elde edilen embriyolar gelişme daha sağlam desen neden olabilir, in vitro oosit olgunlaşma mermi içerir hatları için seçiyoruz.
Prosedür mutasyonlar 24, 25, bir dizi için açık kurtarma veya protein lokalizasyonu görselleştirme için izin verdi. Enjekte mRNA tarafından ifade edilen ürünler değişik sonuçlar 26 yol açabilir, fakat bazı genler için, ürün ekspresyonunun düzenlenmesi, çok önemli olabilir. Tüm kontroller (örneğin, sadece nötr proteinleri kodlayan bu tür kontrol mos gibi bir etki gösterdi henüz tahmin edilmektedir deneyde kullanılanlara benzer özelliklere sahip reaktifler veya RNA'lar ile enjekte edilen embriyolar, bu tür dikkatli olmak da önemlidir GFP gibi), altta yatan değişkenlik uygunsuz sonuçlara neden olabileceğinden.
nt "> döllenme ve ardından in vitro yönetimini içeren bir yaklaşım, etkili bir şekilde ürünleri azaltmayabilir döllenmiş yumurtanın içine RNA, MOS veya proteini enjekte standart yöntem zaten yumurta biriken anne biriken ürün, durumunda özellikle faydalıdır. örneğin CRISPR yer mutant oluşumu gibi diğer son zamanlarda geliştirilen yöntemler, aynı zamanda, maternal olarak ifade edilen genlerin 26 mutant koşulları oluşturmada etkilidir. Bununla birlikte, bu yöntem, çeşitli balık nesillerin gelişimini gerektirir., in vitro oosit olgunlaştırma tekniği hızlı fonksiyonel müdahaleye imkan verir kurtarma ve anne-etki mutasyonların fenokopisi, hem de erken embriyo RNA ve protein ekspresyonu dahil olmak üzere, maternal olarak ifade edilen genlerin, fonksiyonu çalışma.The authors have nothing to disclose.
Biz bu projeyi kolaylaştırıcı aracı vardı Pelegri laboratuar ve balık tesisi idari personel, üyelerine teşekkür etmek istiyorum. Bu proje için destek FP için NIH R56 GM065303 ve Elw NIH 2 T32 GM007133, NIH CCE 5 F31 GM108449-02 ve NIH 2 T32 GM007133 ve NIH RO1 GM065303 tarafından sağlandı
Zebrafish mating boxes | Aqua Schwarz | SpawningBox1 | |
NaCl | Sigma | S5886 | |
KCl | Sigma | P5405 | |
Na2HPO4 | Sigma | S3264 | |
KH2PO4 | Sigma | P9791 | |
CaCl2 | Sigma | C7902 | |
MgSO4-7H2O | Sigma | 63138 | |
NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
Tricaine | Western Chemical | Tricaine-D (MS 222) | FDA approved (ANADA 200-226) |
Tris base | Sigma | 77-86-1 | to prepare 1 M Tris pH 9.0 |
HCl | Sigma | 920-1 | to prepare 1 M Tris pH 9.0 |
Fish net (fine mesh) (4-5 in) | PennPlax | (ThatFishThatPlace # 212370) | available in ThatFishThatPlace |
Plastic spoon | available in most standard stores | ||
Dissecting scissors | Fine Science Tools | 14091-09 | |
Dissecting forceps | Dumont | SS | available from Fine Science Tools |
Dissecting stereoscope (with transmitted light source) | Nikon | SMZ645 | or equivalent |
Reflective light source (LED arms) | Fostec | KL1600 LED | or equivalent |
Petri plates 10 cm diameter | any maker | ||
Eppendorf tubes 1.5 ml | any maker | ||
Ice bucket | any maker | ||
Narrow spatula | Fisher | 14-374 | |
Depression glass plate | Corning Inc | 722085 (Fisher cat. No 13-748B) | available from Fisher Scientific |
Paper towels | any maker | ||
Kimwipes | Kimberly-Clark | 06-666-11 | available from Fisher Scientific |
Timer stop watch | any maker | ||
Wash bottle | Thermo Scientific | 24020500 | available from Fisher Scientific |
beakers, 250 ml (2) | Corning Inc. | 1000250 | available from Fisher Scientific |
Leibovitz'z L-15 medium | Thermofisher | 11415064 | |
NaOH | Sigma | 221465 | for pH'ing |
BSA | Sigma | A2058 | |
17alph-20beta-dihyroxy-4-pregnen-3-one (DHP) | Sigma | P6285 | |
gentamicin | Sigma | G1272 | |
Injection Apparatus | Eppendorf | FemtoJet | or equivalent |
Capillary Tubing for injection needles | FHC | 30-30-1 | or equivalent, Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID with fiber, 100 mm |
Needle puller | Sutter Instruments | Model P-87 | any maker |
Micropipetor (1-20 µl range) with tips | any maker | ||
Micropipetor (20 – 200 µl range) with tips | any maker | ||
Micropipetor (100 – 1000 µl range) with tips | any maker | ||
Conical tubes 15ml | any maker | ||
Conical tubes 50ml | any maker | ||
plastic pipette 10 ml with bulb | any maker | ||
plastic pipette 20 ml with bulb | any maker | ||
Microscope stage Calibration Slide 0.01 mm | AmScope | MR095 | or equivalent |
Reagents for fish water: | |||
Instant Ocean Salt | Drs. Foster & Smith | CD-116528 | |
Sodium bicarbonate (cell culture tested) | Sigma | S5761-1KG | |
Reagents for E3 medium: | |||
NaCl | Sigma | S5886-1KG | |
KCl | Sigma | P5405-500G | |
CaCl2, dihydrate | Sigma | C7902-500G | |
MgSO4, heptahydrate | Sigma | 63138-250G | |
Methylene Blue | Sigma | M9140-25G | |
Fish Food: | |||
Frozen brine shrimp | Brine Shrimp Direct | FBSFKG50 | |
Tetramin Flakes | Drs. Foster & Smith | 16623 |