产妇基因产品的官能化操作使用<em>体外</em斑马鱼>卵母细胞成熟

所有斑马鱼严格按照良好的动物实践中处理的，由有关国家和/或当地的动物福利机构的定义，和所有的动物工作被批准通过适当委员会（威斯康星 – 麦迪逊保证数A3368-01大学）。动物在26.5℃的标准条件下维持。 女性的1.预选注：卵母细胞在成年女性通常跨越范围发育阶段，来自阶段I至V（ 图2）。通过成功自然交配吹扫预先存在的卵母细胞的女性增加卵母分段的同步，作为新开发的卵母细胞显示为第3组，14。内约8天后吹扫，最卵母细胞在早期阶段IV，其最适合在体外成熟的开始。这样的同步提高卵母细胞THA的产率t可经过体外成熟的全部过程中，便于实验操作。参见在成对交配和鱼类水组合物（在此设定为鱼细节先前的说明13,14 G海洋盐和150g的NaHCO 3每1000升反渗透水，pH值6.5〜8.5（优选的范围：6.8 -7.5）和180-360微秒的导电性）。参见Brand 等。 13，用于附加的配方。 8至10天前在体外培养操作，使用鱼网到期望的应变的单个雄性和单个母鱼转移到配合槽。对多套。让他们在交配缸过夜。让他们在晚上和通过第二天下午配合。 使用渔网到交配期间产生卵子，并将它们放到一个单独的油箱女性分开。每天两次与食物混合饲料，这些女性containi纳克盐水虾和鱼食品薄片的大致等量。食物的量应足以提供约20分钟，但不多，喂养时间。 2.成熟培养基的制备注：在体外成熟实验当天准备成熟培养基，从阴除去卵母细胞的1个小时内（请参阅第3节）。 加入20毫升L-谷氨酰胺，pH 7.0的Leibovitz的L-15培养基中，至50mL锥形管中在无菌条件下。它用10N NaOH使pH为9.0。 添加9mL的Leibovitz的L-15培养基，pH为9.0，以2个独立的50mL锥形管中。标签1管“+ DHP”，另一个“-DHP”。 在+ DHP管中，加入17α-20β二羟基-4- pregnen -3-酮的10μL（DHP），DH 2 O的490μL，和500μL10％牛血清白蛋白的（BSA）。 在-DHP管中，加入10毫克/毫升庆大霉素，400 100μL81，L卫生署2 O和10％BSA的500μL。 3.卵母细胞的解剖和体外培养开始注： 在体外培养实验与预先选定的女性后8-10天，他们通过自然交配释放卵子进行。使用由当日成熟培养液中（见第2节）。如果夹层被开始附近的鱼昼夜循环（在实验室中通过预先设定的人工照明的鱼设施确定）13的端部，有可能通过模仿自然交配发生的过程的卵母细胞成熟的适当。这意味着，在该协议最步骤必须在晚上进行，如果鱼被容纳在用标准光循环设施（ 例如，开始步骤3.2在下午6点在设施与上午08时至10时的光周期），尽管其它工作时间段是可能的与适当的时间移光周期。 制备用蒸馏水2 O 0.2％三卡因储备溶液，缓冲至pH 7.0用1M Tris，pH 9.0的，并保持在4℃下该溶液中。这可以提前准备。 发起之前在设施的日常光周期结束实验0-4小时。在250-mL烧杯中，加入20毫升的0.2％三卡因储备溶液，pH为7.0，以80毫升水鱼的并混合。 转移预先选定的女性，以三卡因溶液，并通过曝光过度安乐死他们。离开女性在鳃运动停止后15分钟的三卡因溶液。 用勺子，收集来自三卡因溶液安乐死鱼和鱼水简单冲洗一下。将鱼在纸巾吸去多余水分。 使用干净的刀片在胸鳍的水平斩首安乐死鱼。使用解剖剪刀，使在鱼的腹侧形成纵向切口，从其前端到肛门区延伸。 <li>将鱼上入射光在解剖显微镜下的培养皿。使用一对解剖钳，转移卵巢部分以含有4 Leibovitz的L-15培养基+ DHP的mL的35×10mm的培养皿中。 注：卵巢，含有显影的卵母细胞，将显示为内部体腔内的不透明和块状结构。 使用解剖钳，轻轻地从滤泡群众游离于卵母细胞。排序IV早期阶段的卵母细胞（ 图2B;之前GV击穿，在接近最大尺寸和特征是暗的，不透明的细胞质和一个显而易见的GV位于不对称卵母细胞内）。丢弃在早期阶段（ 图2A）和半透明的，成熟V期蛋（类似于在图2C，但存在于前DHP治疗卵巢）卵母细胞。 注：卵母细胞被选择用于熟化在早期阶段IV，其导致成熟，V期oocyt的最早阶段后在体外培养条件下（ 图2C和D）ES 3。因为阶段的卵母细胞IV正在积极生产产品，操纵在该阶段允许外源产物的RNA通过注射或用于经由引入的MO基因功能的降低的表达。 使用玻璃巴斯德吸管向初期IV的卵母细胞转移到含有4 Leibovitz的L-15培养基+ DHP毫升的第二35×10mm的塑料培养皿中。传递最小量-DHP介质的含有+ DHP溶液的培养皿中。 4.卵母细胞显微注射注：隔离阶段的卵母细胞IV 体外成熟经历可显微注射引入用于功能操作或标记的蛋白质的表达的试剂。试剂，例如mRNA和MOS（见4）的显微注射，典型地进行时，卵母细胞正在经历体外 matu配给在+ DHP介质，以defolliculation之前。如果需要的话，为了允许更多的时间来进行前卵母细胞成熟的操作，注射也可以在-DHP介质中进行，成熟以前，至少2小时。他们随后被转移到+ DHP中。 制备使用标准表达试剂盒的mRNA。 （建议为200pg /μL）在RNA级水保持它们在-80℃下为100-500 pg /μL的库存用于注射在50-500 pg /μL的终浓度。根据制造商的说明在水中的4纳克/μL的浓度制备的MO。在2毫微克的终浓度它们注入/μL（或根据经验确定）。 注：注射通常在+ DHP介质之前defolliculation进行（见第5的说明）。 如果注入的mRNA，前立即注射，使用RNA级反渗透水和0.2M KCl的实现的0.1M的KCl的最终溶液稀释的mRNA。如果注入的MO，之前立即注射，使用反渗透水和0.2M KCl的实现的0.1M的KCl的最终溶液稀释所述MOS至所需浓度。 手动保持用细镊子卵母细胞和注入约1纳升成使用与拉玻璃毛细吸管制成的针野生型IV期的卵母细胞。 通过拉动加热玻璃毛细管，加载溶液被注入，并用钳子打破针尖，如在协议标准注射到斑马鱼早期胚胎15先前所描述的制备的玻璃针。 注：这是有益的，如果针头有一个渐进的锥度，而不是突然的一个;这允许更大的灵活性在针尖断裂的位置而言，也有助于防止注射胚胎的破坏。使用相同的针和溶液作为胚胎注射，调整通过确定预的注射体积产生期望的体积微量压力设置。这些设置可由下式确定模拟注入矿物油的在显微镜阶段校准载玻片（0.01毫米），调整设置微量以获得注射溶液的丸所需直径的下降，如前所述15。 5.卵母细胞成熟和Defolliculation 注：在卵母细胞成熟，卵母细胞会逐渐变得透明，从而允许对成功培养条件的评估。 继续温育未成熟（和，如果合适的话，注入）在+ DHP介质的卵母细胞在26.5℃下，周期性地检查（每隔30分钟），以确保所述的卵母细胞保持完整，并通过逐渐变得半透明正在进行适当的成熟（参见图2C） 。 用巴斯德吸管取出所有裂解卵母细胞和丢弃在实验室废物烧杯中保持介质的质量。交换培养基用新鲜+ DHP介质的约一半体积，以保持透明溶液，这取决于卵母细胞裂解的量。 允许在体外成熟进行，直到大部分的卵母细胞成为半透明的，并具有一个GV即不再明显（在DHP治疗约2小时，参见图2C相比至D为）。查看它们与透射光光学解剖显微镜下。 从每个成熟卵母细胞中除去最外面的卵泡膜。使用特细镊子使卵泡膜撕裂的区域与卵母细胞和膜之间增加的空间。剥离膜的一部分，并滚动卵母细胞从膜的同时按住剥离部分。 注意：下面的绒毛膜将通常保持与在该过程中蛋密切关联;之后蛋行为ivation，其膨胀以形成用于胚胎的保护层。 转移defolliculated卵母细胞在介质的最小体积（典型地，在小于20μL转移约5-10成熟的卵母细胞）与培养（+ DHP）介质几滴到培养皿中，并进行到受精。 6. 体外培养卵母细胞的受精注：在冰上精子溶液，制备以下，将保持其效力为约2小时。 制备接近卵母细胞成熟步骤的结束和前一个精子溶液使用睾丸从5名男defolliculation在Hanks'溶液的500微升，如先前16,17说明。 添加10-50微升精解到+ DHP培养基defolliculated卵母细胞。等待10秒。 使用移液管，加入胚胎（E3）中的几滴卵母细胞。等待1分钟，然后淹没PL吃了E3中。 注：E3培养基的组成如下：5mM的NaCl的，0.17毫米氯化钾，0.33毫米氯化钙2，0.33毫摩尔MgSO 4干燥，和1-5％亚甲蓝13。 重复步骤5.3，6.2和6.3获得受精胚胎的数量更多。 允许受精的胚胎发展。使用具有透过光的光学解剖显微镜通过裂解阶段，观察进展以确保成功受精，如先前对受精17和分段18描述。