والسريعة، طريقة قابلة للعزل، دراسة وظيفية، وتحليل المصفوفة خارج الخلية المشتقة من خلية
Summary
The extracellular matrix plays a major role in defining the microenvironment of cells and in modulating cell behavior and phenotype. We describe a rapid method for the isolation of cell-derived extracellular matrix, which can be adapted to different scales for microscopic, biochemical, proteomic, or functional studies.
Abstract
The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and pathological processes. However, the isolation of ECM, from tissues or cell culture, is complicated by the insoluble and cross-linked nature of the assembled ECM and by the potential contamination of ECM extracts with cell surface and intracellular proteins. Here, we describe a method for use with cultured cells that is rapid and reliably removes cells to isolate a cell-derived ECM for downstream experimentation.
Through use of this method, the isolated ECM and its components can be visualized by in situ immunofluorescence microscopy. The dynamics of specific ECM proteins can be tracked by tracing the deposition of a tagged protein using fluorescence microscopy, both before and after the removal of cells. Alternatively, the isolated ECM can be extracted for biochemical analysis, such as sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoblotting. At larger scales, a full proteomics analysis of the isolated ECM by mass spectrometry can be conducted. By conducting ECM isolation under sterile conditions, sterile ECM layers can be obtained for functional or phenotypic studies with any cell of interest. The method can be applied to any adherent cell type, is relatively easy to perform, and can be linked to a wide repertoire of experimental designs.
Introduction
على مدى العقود القليلة الماضية، المصفوفة خارج الخلية (ECM) أصبح معترف بها بوصفها بيئة متنوعة ودينامية، والمعقدة التي تشارك في عمليات الخلية الفسيولوجية والمرضية متعددة. على مستوى الأنسجة، وECM تؤثر إشارات الخلية، والحركة، والتمايز، الأوعية الدموية، بيولوجيا الخلايا الجذعية، تكون الأورام، والتليف، الخ 1،2. دراسة منظمة ECM والعمليات التي تعتمد على ECM وبالتالي له آثار واسعة لبيولوجيا الخلية وعلم وظائف الأعضاء الأنسجة. من أجل التوصل إلى فهم الآلية من تكوين ECM، والتنظيم، والخصائص الفنية، مطلوبة طرق لعزل دقيقة من ECM. في حين أن أقرب تحديد البروتينات ECM الاعتماد عليها بمعزل عن الأنسجة 3، أصبح إعداد ECM من الخلايا المستزرعة الآن أكثر انتشارا.
عزل وتحليل ECM المستمدة من الخلايا معقدة لسببين رئيسيين. أولا، وجود خلايا ويمكن أن الأشعة تحت الحمراء البروتينات داخل الخلايا وفيرة تجعل من الصعب عزل ECM كهيكل خارج الخلية منفصلة. في الواقع، بعض البروتينات ECM لها أدوار داخل الخلية وكذلك في ECM 4؛ وبالتالي، فإن إزالة فعالة من البروتينات داخل الخلايا من ECM المستمدة من الخلية الحيوية إذا كانت دراسة البروتينات داخل ECM لا ينبغي الخلط بينه وبين أدوارهم داخل الخلية. ثانيا، يتكون ECM المستمدة من خلية العديد من الكبيرة والبروتينات بلازميدة قليلة القسيمات، التي غالبا ما تكون عبر ربط على التجمع ECM تساهميا وبالتالي فهي غير قابلة للذوبان في المنظفات القياسية. هذه الخصائص يمكن أن يعقد استخراج وتحليل مزيد من ECM. لمعالجة هذه القضايا، لا بد من طريقة تمكن الفصل الفعال للبروتينات ECM من المكونات الخلوية.
وقد وصفت العديد من الطرق في الأدب لعزل ECM إما من زراعة الخلايا أو الأنسجة مقتطفات. وتهدف العديد من هذه الطرق في استخراج العلاقات العامة ECM وفيرةotein، الكولاجين، من أنسجة وتشمل استخدام أملاح محايدة 3، الظروف الحمضية 5،6، أو البيبسين 7. عزل ECM إجمالي مقتطفات من الأنسجة غالبا ما ينطوي على decellularization من الأنسجة قبل عزل ECM. على سبيل المثال، فقد وصفت طريقة الاستخلاص المتسلسل الذي يعزل ECM من أنسجة القلب الإنسان 8. أولا، تم استخراج البروتينات ECM ملزمة فضفاضة مع 0.5 M كلوريد الصوديوم قبل كبريتات الصوديوم دوديسيل (SDS) كان يستخدم لإزالة الخلايا. وأخيرا، تم استخراج البروتينات ECM المتبقية باستخدام 4 M غوانيدين 8. ECM يمكن أيضا أن تذوب من العينات decellularized باستخدام 8 M اليوريا 9. تقنيات أخرى تستخدم المنظفات، مثل حمض deoxycholic 10، لاستخراج كل من الخلايا وECM قبل فصل البروتينات ECM غير قابلة للذوبان من الخلايا المحللة للذوبان عن طريق الطرد المركزي.
طريقة لعزل وتحليل ECM المستمدة من الخلية المذكورة في هذا التقرير يوفر إعدادها في صورة جاهزةطريقة ducible لإزالة المواد خلية، وترك ECM المستمدة من الخلايا التي يمكن تحليلها من قبل في المناعي الموقع أو المستخرجة لمزيد من التحليل الكيميائي الحيوي. ويمكن تكييف هذه الطريقة لأي نوع من الخلايا الملتصقة ويمكن زيادتها لإجراءات المصب، مثل immunoblotting أو قياس الطيف الكتلي، أو الاستفادة من ECM معزولة في الدراسات الفنية. ويمكن أيضا استخدام أسلوب بالتزامن مع الفحص المجهري متحد البؤر الخلايا الحية لتعقب ترسب ECM من البروتين الموسومة الفائدة في الوقت الحقيقي. ويتحقق ذلك من خلال استخدام طبق الشبكية، القاع الزجاجي. وعموما، يوفر نهج العزلة دقيقة من ECM المستمدة من الخلايا، وكذلك مجالا لتحديد ورصد ترسب وديناميكية من البروتينات ECM الفردية.
Protocol
Representative Results
Discussion
خطوات حاسمة في إطار بروتوكول
طريقة لديه بعض الخطوات الحاسمة التي يجب اتباعها لضمان العزلة الناجحة وتحليل ECM. على سبيل المثال، يتم استخدام هيدروكسيد الأمونيوم لإزالة الخلايا وعزل ECM للتحليل. على الرغم من هيدروكسيد الأمونيوم مستقرة في المحاليل المائية في الظلام ويمكن تخزين في درجة حرارة الغرفة، زجاجات يجب بإحكام إعادة مختومة بين كل استعمال. لأن الغاز قد تتبخر من الحل، مما يقلل من تركيز، ونحن نوصي بشدة البدء في زجاجة جديدة كل 6-8 أسابيع. وبالإضافة إلى ذلك، ينبغي أن يكون الحل العمل حديثا لكل تجربة. ومن الضروري أيضا أن الخلايا تتم إزالة بشكل كامل مع يغسل وفيرة في دي المتأينة المياه. إذا لم يتم تنفيذ هذه الخطوات على نحو كاف، قد تبقى المواد الخلوية على طبق وتلوث التحليلات المصب. إذا تم نمت الخلايا لمدة 10 يوما أو أكثر، قد تكون هناك حاجة إلى الماء يغسل إضافية. من المهم أن نالمؤسسة التجارية العمانية أن طبقة ECM معزولة عادة رقيقة جدا بالمقارنة مع الخلايا 11، لذلك هناك حاجة إلى الحذر عند تحديد ECM أثناء التصوير. لاستخراج الفعال للECM معزولة في عينة العازلة SDS-PAGE، فمن الضروري أن المخزن المؤقت عينة يحتوي على عامل مختزل. لإزالة الأكثر فعالية لإدارة المحتوى في المؤسسة، يجب استخدام المغلي الساخنة عينة العازلة. لالتجارب التي ستحل عينات ECM من قبل الكهربائي SDS-PAGE لتلطيخ البروتين أو البروتينات، فمن الأهمية بمكان لتحقيق عينة مركزة عن طريق كشط عدة لوحات قيمتها من ECM في نفس قسامة من عينة العازلة.
التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها
إنتاج وإفراز البروتينات ECM يمكن أن تختلف بشكل كبير بين أنواع الخلايا، لذلك الفترات الزمنية لإفراز وترسب ECM وينبغي أن تحدد من جديد لكل نوع من الخلايا. ومن المهم أيضا أن ندرك أن تكوين ECM ستتغير حيوي بالنسبة رس كثافة الخلايا والوقت في الثقافة 18. ينبغي أن تؤخذ هذه العوامل في الاعتبار عند تصميم التجارب. ومن الواضح أن اختيار نوع من الخلايا لهذا الأسلوب هو المهم، وخاصة عند استخراج ECM لتحليلها من قبل مطياف الكتلة، والتي قد تتطلب كمية كبيرة من البروتين الكلي ECM.
القيود المفروضة على تقنية
والخلايا التي تفرز مستويات منخفضة جدا من البروتينات ECM أن يكون أكثر تحديا للاستخدام مع هذا الأسلوب. الخلايا غير ملتصقة والثقافات خلية 3D، أو المقايسات غزو الخلايا غير مناسبة في الوقت الحاضر لعزل ECM بواسطة هذه الطريقة. هذه الطريقة الأنسب للاستخدام مع معيار "2-الأبعاد" مزارع الخلايا. لأن استخراج هيدروكسيد الأمونيوم يزيل الخلايا تماما، ECM ترتبط مع الجانبين العلوي من الخلايا وإفراز، ولكن غير عبر ربط، وأيضا إزالة البروتينات ECM، وترك على طبق طبقة رقيقة من ECM تجميعها من تحت وحول الأسس من الخلايا 11،17 </سوب>. ما هو معقد لقياس مدى ECM أطلقه استخراج هيدروكسيد الأمونيوم، لأن المواد صدر يتضمن أيضا البروتينات ECM التي هي داخل الخلايا إما قبل أو بعد إفراز امتصاص من سطح الخلية.
أهمية تقنية مع الاحترام لالحالية / الطرق البديلة
القدرة على إجراء مجموعة واسعة من التجارب مع ECM معزولة مهمة في سياق بيولوجيا الخلية وعلم وظائف الأعضاء الأنسجة، ولها أيضا انعكاسات على مجالات ترميم الأنسجة وهندسة الأنسجة. طريقة مزاياه على المواد الهلامية التي تشكلت من الكولاجين المنقاة أو غيرها من البروتينات ECM النقي في أن الخلايا تجميع الهياكل ECM المعقدة في حجمها الأصلي، مع آليات عبر ربط الأم ومع بروتينات ECM الفردية موجودة في النسب المناسبة لنوع الخلية الأصلية. على سبيل المثال، أظهرت دراسة البروتين من RCS ECM matrilins وفيرة وCOMP / TSP5، كما هو متوقع لوECM الغضروفية 19،20 (الشكل 4). بشكل عام، ويعوق تحليل ECM المستمدة من الخلايا بحكم طبيعته باعتباره، شبكة متعددة البروتين واسعة النطاق التي ينتج في يشابك التساهمية والذوبان من العديد من البروتينات ECM، وأيضا من خلال التلوث المحتمل للECM مقتطفات مع البروتينات داخل الخلايا. إجراء متعدد خطوة تهدف إلى عزل جزء ECM من الأنسجة لتحليل البروتين أسفرت عن 8٪ من البروتينات ECM في مجموعة مجموع من البروتينات التي تم تحديدها 21. ومع ذلك، كانت الببتيدات من البروتينات ECM 73٪ من إجمالي الببتيدات التي تم تحديدها. هذه طريقة لعزل وتحليل ECM المستمدة من الخلايا بسرعة وبشكل موثوق يزيل المواد الخلوية مع الإبقاء على البروتينات ECM. هذه الطريقة يمكن استخدامها لمجموعة من أنواع الخلايا والتطبيقات المصب ويسهل تحليل البيولوجيا ECM وخلية ECM التفاعلات في زراعة الخلايا. لدينا بروتوكولات بالتفصيل كيف يمكن تطبيق الطريقة على مختلف المستويات لمعالجة مجموعة واسعة من إكسبالأسئلة erimental فيما يتعلق منظمة ECM، وديناميات، أو تكوينها، والآثار الفنية من ECM معزولة عن الخلايا.
التطبيقات المستقبلية أو الاتجاهات بعد اتقان هذه التقنية
وبالنظر إلى المستقبل، يمكن تكييفها طريقة للاستخدام مع الثقافات خلية 3D. هذا من شأنه توسيع أهميتها الفسيولوجية. الأنسجة الأم Decellularized لديها امكانات كبيرة كما سقالة لتجديد الأنسجة المفقودة أو التالفة وكبديل لزراعة الأعضاء، مثل القلب بعد فشل 22. لديه القدرة على التغلب على مشاكل توافر المانحة وimmunorejection. التطبيقات المستقبلية للطريقة المبينة في هذا التقرير أن التحقيق في الاستخدام مع الثقافات خلية 3D أو decellularization الأنسجة، والتي من شأنها زيادة نطاق هذا النهج.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن في غاية الامتنان للدكتور بليندا ويلارد، البروتيوميات ومختبر الايض، معهد بحوث ليرنر، كليفلاند كلينك، لإجراء تحليل البروتينات من RCS ECM. ونحن نعترف بدعم مالي من مجلس البحوث theMedical المملكة المتحدة، منح عدد K018043، لJCA.
Materials
| Antibody to COL1A1 | Novus | NB600-408 | Rabbit polyclonal. Reacts with other fibrillar collagens as well as collagen I. IF: 1/200 |
| Antibody to fibronectin | Sigma | F3648 | Rabbit polyclonal. WB: 1/600 for 1.5 hr. IF: 1/200 |
| Antibody to thrombospondin 1 | ThermoFisher | MA5-13398 | Mouse monoclonal clone A6.1. WB: 1/150 for 1.5 hr |
| Antibody to RFP | Abcam | ab62341 | Rabbit polyclonal. WB: 1/2000 for 2 hr |
| Antibody to β-actin | Sigma | A1978 | Mouse monoclonal clone AC-15. WB: 1/10000 for 1.5 hr |
| Antibody to α-tubulin | Sigma | T9026 | Mouse monoclonal clone DM1A. WB: 1/5000 for 1.5 hr |
| Cell Tracker Green | ThermoFisher | C2925 | Fluorescent cell marker. Use at 1 µM for 30 min |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC)-Phalloidin | Sigma | P-5282 | Stock = 50mg/ml in DMSO.1/50 for 45 min |
| FITC-conjugated goat anti-mouse IgG | Sigma | F8771 | IF: 1/50 for 1 hr |
| FITC-conjugated sheep anti-rabbit IgG | SIgma | F7512 | IF: 1/50 for 1 hr |
| Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse IgG | LI-COR | 926-80010 | WB: 1/50000 for 1 hr |
| HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG | LI-COR | 926-80011 | WB: 1/100000 for 1 hr |
| Vectorshield mounting medium with DAPI | Vector | H-1200 | Store at 4 C in the dark |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma | D6429 | Warm before use |
| Fibroblast growth medium | PromoCell | C-23010 | Warm before use, supplement with 50 µg / mL ascorbic acid |
| Phenol red-free DMEM | ThermoFisher | 21063-029 | Warm before use |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | T3924 | Warm before use |
| Gridded glass-bottomed dish | MatTek | P35G-2-14-C-GRID | |
| NH4OH, 28% – 30% solution | Sigma | 221228 | Dilute to 20 mM in de-ionised water. Once opened store in the dark, tightly capped. |
| Paraformaldehyde, 16 % solution | Alfa Aesar | 43368 | Dilute to 2 % (v/v) in PBS |
| Deoxycholic acid | Sigma | D2510 | Use at 2 % (v/v) final concentration |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Dilute to 0.5 % (v/v) final concentration |
| GelCode Blue stain reagent | ThermoFisher | 24590 | Protein stain for SDS-PAGE gels |
| Precision Plus protein standards | Biorad | 161-0374 | Protein standards for SDS-PAGE gels |
| Trans-Blot SD Semi Dry transfer cell | Biorad | 1703940 | Efficient transfer of high molecular weight proteins |
| PVDF transfer membrane | Millipore | ISEQ00010 | Immobilon-PSQ |
| Ponceau S stain | Sigma | P7170 | Reversible protein stain for PVDF membrane |
| WesternSure Enhanced chemiluminescence (ECL) substrate | LI-COR | 926-80200 | |
| High performance chemiluminescence film | GE Healthcare | 28906837 | |
| Sterile filtration unit, MILLEX-GV | Millipore | ML481051 | |
| SP8 AOBS confocal laser scanning microscope | Leica | Environmental chamber needed for temperature and CO2 control (Life Imaging Services) | |
| Key: IF, Immunofluorescence; WB, Western Blot |
References
- Bonnans, C., Chou, J., Werb, Z. Remodelling the extracellular matrix in development and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 786-801 (2014).
- Hynes, R. O., Naba, A. Overview of the matrisome–an inventory of extracellular matrix constituents and functions. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, a004903 (2012).
- Gross, J., Highberger, J. H., Schmitt, F. O. Extraction of Collagen from Connective Tissue by Neutral Salt Solutions. Proc Natl Acad Sci U S A. 41, 1-7 (1955).
- Hellewell, A. L., Adams, J. C. Insider trading: Extracellular matrix proteins and their non-canonical intracellular roles. Bioessays. 38, 77-88 (2016).
- Li, D., Yang, W., Li, G. Y. Extraction of native collagen from limed bovine split wastes through improved pretreatment methods. Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 83, 1041-1048 (2008).
- Strawich, E., Nimni, M. E. Properties of a collagen molecule containing three identical components extracted from bovine articular cartilage. Biochemistry. 10, 3905-3911 (1971).
- Kim, B. S., et al. Human collagen isolated from adipose tissue. Biotechnol Prog. 28, 973-980 (2012).
- Barallobre-Barreiro, J., Didangelos, A., Yin, X., Domenech, N., Mayr, M. A sequential extraction methodology for cardiac extracellular matrix prior to proteomics analysis. Methods Mol Biol. 1005, 215-223 (2013).
- Carter, W. G. Transformation-dependent alterations is glycoproteins of extracellular matrix of human fibroblasts. Characterization of GP250 and the collagen-like GP140. J Biol Chem. 257, 13805-13815 (1982).
- Sechler, J. L., Takada, Y., Schwarzbauer, J. E. Altered rate of fibronectin matrix assembly by deletion of the first type III repeats. J Cell Biol. 134, 573-583 (1996).
- Adams, J. C., Bentley, A. A., Kvansakul, M., Hatherley, D., Hohenester, E. Extracellular matrix retention of thrombospondin 1 is controlled by its conserved C-terminal region. J Cell Sci. 121, 784-795 (2008).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Hillenkamp, F., Karas, M. Mass spectrometry of peptides and proteins by matrix-assisted ultraviolet laser desorption/ionization. Methods Enzymol. 193, 280-295 (1990).
- Davis, M. T., et al. Automated LC-LC-MS-MS platform using binary ion-exchange and gradient reversed-phase chromatography for improved proteomic analyses. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 752, 281-291 (2001).
- Burnette, W. N. "Western blotting": electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Anal Biochem. 112, 195-203 (1981).
- Soucy, P. A., Werbin, J., Heinz, W., Hoh, J. H., Romer, L. H. Microelastic properties of lung cell-derived extracellular matrix. Acta Biomater. 7, 96-105 (2011).
- Hellewell, A. L., Gong, X., Scharich, K., Christofidou, E. D., Adams, J. C. Modulation of the extracellular matrix patterning of thrombospondins by actin dynamics and thrombospondin oligomer state. Biosci Rep. 35, (2015).
- Mumby, S. M., Abbott-Brown, D., Raugi, G. J., Bornstein, P. Regulation of thrombospondin secretion by cells in culture. J Cell Physiol. 120, 280-288 (1984).
- Myllyharju, J. Extracellular matrix and developing growth plate. Curr Osteoporos Rep. 12, 439-445 (2014).
- Roughley, P. J. Articular cartilage and changes in arthritis: noncollagenous proteins and proteoglycans in the extracellular matrix of cartilage. Arthritis Res. 3, 342-347 (2001).
- Naba, A., et al. The matrisome: in silico definition and in vivo characterization by proteomics of normal and tumor extracellular matrices. Mol Cell Proteomics. 11, M111 014647 (2012).
- Sanchez, P. L., et al. Acellular human heart matrix: A critical step toward whole heart grafts. Biomaterials. 61, 279-289 (2015).
