Hücre kaynaklı Ekstrasellüler Matrix A Hızlı, İzolasyon, Fonksiyonel Çalışmaları Ölçeklenebilir Yöntem ve Analiz
Summary
The extracellular matrix plays a major role in defining the microenvironment of cells and in modulating cell behavior and phenotype. We describe a rapid method for the isolation of cell-derived extracellular matrix, which can be adapted to different scales for microscopic, biochemical, proteomic, or functional studies.
Abstract
The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and pathological processes. However, the isolation of ECM, from tissues or cell culture, is complicated by the insoluble and cross-linked nature of the assembled ECM and by the potential contamination of ECM extracts with cell surface and intracellular proteins. Here, we describe a method for use with cultured cells that is rapid and reliably removes cells to isolate a cell-derived ECM for downstream experimentation.
Through use of this method, the isolated ECM and its components can be visualized by in situ immunofluorescence microscopy. The dynamics of specific ECM proteins can be tracked by tracing the deposition of a tagged protein using fluorescence microscopy, both before and after the removal of cells. Alternatively, the isolated ECM can be extracted for biochemical analysis, such as sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoblotting. At larger scales, a full proteomics analysis of the isolated ECM by mass spectrometry can be conducted. By conducting ECM isolation under sterile conditions, sterile ECM layers can be obtained for functional or phenotypic studies with any cell of interest. The method can be applied to any adherent cell type, is relatively easy to perform, and can be linked to a wide repertoire of experimental designs.
Introduction
Son birkaç on yıl içinde, hücre dışı matriks (ECM) çoklu hücre fizyolojik ve patolojik süreçlerde rol alan bir, çeşitli dinamik ve karmaşık bir ortam olarak kabul haline gelmiştir. Doku düzeyinde, ECM hücre sinyallerini, motilite, farklılaşma, anjiyogenez, kök hücre biyolojisi, tümörogenez, fibrozis, vb 1,2 etkiler. ECM organizasyon ve ECM-bağımlı süreçlerin çalışma böylece hücre biyolojisi ve doku fizyolojisi için geniş etkileri vardır. ECM kompozisyon, organizasyon ve fonksiyonel özellikleri bir mekanistik anlayışa ulaşmak, ECM doğru izolasyon yöntemleri gereklidir. Doku 3 izolasyon güvenilemez ECM proteinleri erken tespiti ise, kültürlenmiş hücrelerden ECM'nin hazırlanması artık daha yaygın hale gelmiştir.
hücre kökenli ECM izolasyonu ve analiz iki ana nedenden dolayı karmaşıktır. İlk olarak, hücrelerin varlığı veir bol hücre içi proteinleri zor bir ayrık hücre dışı bir yapı olarak ECM izole etmek yapabilirsiniz. Gerçekten de, bazı ECM proteinleri hücre içinde hem de ECM 4 rollere sahiptir; ECM içinde proteinlerin çalışma, hücre içinde kendi rolleri ile karıştırılmamalıdır Bu nedenle, hücre kaynaklı ECM'den hücre içi proteinlerin etkili şekilde uzaklaştırılması önem taşımaktadır. İkinci olarak, hücre-türevi ECM genellikle kovalent olarak çapraz bağlantılı ECM montajı üzerine ve standart deterjanlarda nedenle çözünmeyen birçok büyük, oligomerik proteinler, oluşmaktadır. Bu özellikler çıkarma ve ECM daha fazla analiz karmaşık hale getirebilir. Bu sorunları çözmek için, bir yöntem olup, hücresel bileşenlerden ECM proteinlerinin verimli ayrılmasını sağlayan gereklidir.
Çeşitli yöntemler, hücre kültürü veya doku ekstreleri ya ECM izolasyonu için literatürde tarif edilmiştir. Bu yöntemlerin birçoğu bol ECM pr çıkarılması hedefleniyorotein dokulardan kollajen ve nötr tuzlar 3, asidik koşullar 5,6 veya pepsin 7 kullanımını içerir. Doku özütlerinin toplam ECM izolasyonu genellikle önceden ECM izolasyonuna doku decellularization içerir. Örneğin, bir sıralı özütleme yöntemi, insan kardiyak doku 8 ECM izole tarif edilmiştir. İlk olarak, gevşek bağlı ECM proteinleri sodyum dodesil sülfat (SDS) önce, 0.5 M NaCI ile ekstre edildi hücreleri çıkarmak için kullanılmıştır. Son olarak, kalan ECM proteinleri 4 M guanidin 8 ile ekstre edildi. ECM ayrıca 8 M üre 9 kullanarak hücresizleştirilmiş örneklerinden çözündürülebilir. Diğer teknikler santrifüjleme ile çözünür hücre lizatından çözünmeyen ECM proteinlerinin ayrılması önce her iki hücreleri ve ECM çıkarmak için, örneğin deoksikolik asit 10 olarak deterjan kullanımı.
izolasyon ve bu raporda açıklanan hücre kökenli ECM analizi için yöntem Repro sağlarhücre malzemenin çıkartılması in situ imünofloresansta analiz ya da daha fazla biyokimyasal analiz için elde edilebilir hücresinden türetilmiş ECM bırakmak için tekrarlanabilir bir yöntem. Bu yöntem, herhangi bir yapışık hücre tipi için uyarlanabilir ve immunoblotting ya da kütle spektrometrisi, veya fonksiyonel çalışmalarda izole ECM'nin kullanımı için alt-prosedürler için ölçeklenebilir. Yöntem ayrıca, gerçek zamanlı olarak ilgi konusu bir etiketli protein ECM birikmesini izlemek için canlı hücre konfokal mikroskobu ile bağlantılı olarak kullanılabilir. Bu ızgaralı cam tabanlı bir çanak kullanımı ile elde edilir. Genel olarak, yaklaşım, hücre-türevli ECM ve tespit etmek ve çökelmesini ve bireysel ECM proteinlerinin dinamiklerini izlemek için kapsam doğru bir izolasyon sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokol çerçevesinde kritik adımlar
yöntem ECM başarılı izolasyon ve analiz sağlamak için takip edilmesi gereken bazı kritik adımlar vardır. Örneğin, amonyum hidroksit hücreleri çıkarmak için ve analiz için ECM izole etmek için kullanılır. amonyum hidroksit, karanlıkta, sulu çözeltiler içinde kararlı olan ve oda sıcaklığında muhafaza edilebilir olsa da, şişe sıkıca her kullanım arasında yeniden sızdırmaz hale getirilmelidir. Gaz ve böylece konsantrasyonunu azaltarak, çözümden buharlaşması olabilir, çünkü biz güçlü bir taze şişeyi her 6-8 haftada başlayan öneririz. Buna ek olarak, çalışma çözeltisi, her bir deney için taze yapılmış olmalıdır. Hücrelerin tam de-iyonize su içinde bol yıkar ile kaldırıldığını da esastır. Bu adımlar yeterince yerine getirilmemesi halinde, hücresel materyal çanak kalır ve alt analizler kirletebilir. Hücreler 10 gün ya da daha uzun süre için yetiştirildiği takdirde, ilave su yıkama gerekli olabilir. Bu n önemlidirgörüntüleme sırasında ECM belirlerken dikkat gerekir, böylece izole ECM tabakası, tipik olarak hücrelere 11 ile karşılaştırıldığında çok ince ote. SDS-PAGE numune tampon maddesi izole edilmiş ECM etkin ekstre için, numune tamponu bir indirgeme ajanı içerir esastır. ECM en etkili kaldırılması için, kaynar örnek tamponu kullanılmalıdır. ECM örnekleri protein lekeleme veya proteomik için SDS-PAGE elektroforezi ile çözülecektir olan deneyler için, örnek tamponu, aynı kısım halinde ECM'nin birkaç tabak değerinde kazıyarak konsantre örneği elde etmek için kritiktir.
Değişiklikler ve Sorun Giderme
ECM proteinlerinin üretimi ve salgılanması hücre tipleri arasında önemli ölçüde değişebilir, bu nedenle ECM sekresyon ve birikimi için zaman periyodu, her hücre türü için de novo belirlenmelidir. ECM kompozisyon ilişkisi t dinamik değişecek farkında olmak da önemlidirkültür 18 o hücre yoğunluğu ve süresi. Deney tasarlarken Bu faktör dikkate alınmalıdır. Toplam ECM proteininde bir miktar gerekebilir kütle spektrometresi ile analiz için ECM ekstre özellikle Açıkçası, bu yöntem için bir hücre tipinin seçimi önemlidir.
Tekniğin Sınırlamalar
ECM proteinlerinin çok düşük seviyelerde salgılayan hücreler bu yöntemle kullanım için daha zor olacaktır. Yapışkan olmayan hücreler, 3D hücre kültürleri veya hücre istilası tahlilleri bu yöntemle ECM izolasyonu için şu anda uygun değildir. yöntemi standart "2 boyutlu" hücre kültürleri ile kullanım için uygundur. amonyum hidroksit ekstraksiyon tamamen ECM hücrelerin üst tarafı ile ilişkili ve salgılanmış hücreleri ortadan kaldırır, fakat sınırlayıcı olmayan çapraz bağlı olduğundan, ECM proteinleri aynı zamanda aşağıdaki ve bazlar çevresinde tabak üzerine monte ECM ince bir tabaka bırakmak çıkarılır hücrelerin 11,17 arasında </> Sup. Malzeme, aynı zamanda serbest salgılanmadan önce ya da hücre yüzeyinden alımından sonra da hücre içi ECM proteinlerini içerdiği için, amonyum hidroksit ekstre serbest ne kadar ECM ölçmek için karmaşıktır.
Mevcut / Alternatif Yöntemler Göre Tekniği Önemi
İzole ECM ile deneyler geniş bir yelpazede yürütebilme hücre biyolojisi ve doku fizyolojisi bağlamında önemlidir ve aynı zamanda doku rejenerasyonu ve doku mühendisliği alanlarında etkileri vardır. yöntem, hücrelerin, doğal çapraz bağlama mekanizmaları ile kökenli hücre tipine uygun oranlarda mevcut tek tek ECM proteinleri ile, kendi ana boyutta karmaşık ECM yapıları monte bu saflaştırıldı kollajenler ya da saflaştırılmış ECM proteinleri oluşan jeller üzerinde avantajlara sahiptir. beklenen Örneğin, RCS ECM'nin proteomik çalışmada, bol matrilins COMP / TSP5 gösterdikıkırdak ECM 19,20 (Şekil 4). Genel olarak, hücre kaynaklı ECM analizi kovalent çapraz bağlanma ile sonuçlanan bir geniş, çok-protein ağı ve bir çok ECM proteinleri çözülemediği olma özelliği ile engellenmektedir ve ayrıca ECM potansiyel kirlenme hücre içi proteinleri ile ayıklar. Proteomik analizi için doku ECM fraksiyonunu izole etmek için tasarlanmış bir çok-aşamalı bir prosedür 21 tespit toplam protein grubu ECM proteinlerinin% 8 elde edildi. Ancak, ECM proteinleri gelen peptidler belirlenen toplam peptitlerin% 73 idi. hücresinden türetilmiş ECM izolasyonu ve analiz için bu yöntem, hızlı ve güvenilir bir şekilde ECM proteinlerini muhafaza ederken, hücresel maddeyi temizler. Bu yöntem, hücre tipleri ve alt bir uygulama aralığı için kullanılan ve hücre kültüründe ECM biyoloji ve hücre-ECM etkileşimlerin analizine kolaylaştırır. yöntem farklı ölçeklerde nasıl uygulanabileceğini Bizim protokoller detay exp geniş bir yelpazede ele almakECM organizasyon, dinamikleri, ya da kompozisyon ile ilgili erimental sorular ve hücreler izole ECM fonksiyonel etkileri.
Bu Tekniği Mastering sonra gelecek Uygulamalar veya Tarifi
Geleceğe bakıldığında, yöntem, 3D hücre kültürleri ile kullanım için adapte edilebilir; Bu fizyolojik alaka genişletmek olacaktır. Hücresizleştirilmiş yerel doku kayıp ya da hasar görmüş doku rejenerasyonu için ve kalp yetmezliği 22 sonra da transplantasyon alternatif olarak bir iskele olarak büyük bir potansiyele sahiptir. Verici kullanılabilirliği ve immunorejection sorunlarının üstesinden gelmek için bir potansiyele sahiptir. Bu raporda açıklanan yöntemin gelecekte uygulamaları daha bu yaklaşımın kapsamını artıracak 3D hücre kültürleri veya doku Decellularization ile kullanımını araştırmak olabilir.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz RCS ECM proteomik analizi yürütmek için, Dr. Belinda Willard, Proteomik ve Metabolomik Laboratuvarı, Lerner Araştırma Enstitüsü, Cleveland Clinic en müteşekkiriz. Biz JKA'li için, numara K018043 hibe, theMedical Araştırma Kurumu İngiltere'de mali destek için minnettarım.
Materials
| Antibody to COL1A1 | Novus | NB600-408 | Rabbit polyclonal. Reacts with other fibrillar collagens as well as collagen I. IF: 1/200 |
| Antibody to fibronectin | Sigma | F3648 | Rabbit polyclonal. WB: 1/600 for 1.5 hr. IF: 1/200 |
| Antibody to thrombospondin 1 | ThermoFisher | MA5-13398 | Mouse monoclonal clone A6.1. WB: 1/150 for 1.5 hr |
| Antibody to RFP | Abcam | ab62341 | Rabbit polyclonal. WB: 1/2000 for 2 hr |
| Antibody to β-actin | Sigma | A1978 | Mouse monoclonal clone AC-15. WB: 1/10000 for 1.5 hr |
| Antibody to α-tubulin | Sigma | T9026 | Mouse monoclonal clone DM1A. WB: 1/5000 for 1.5 hr |
| Cell Tracker Green | ThermoFisher | C2925 | Fluorescent cell marker. Use at 1 µM for 30 min |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC)-Phalloidin | Sigma | P-5282 | Stock = 50mg/ml in DMSO.1/50 for 45 min |
| FITC-conjugated goat anti-mouse IgG | Sigma | F8771 | IF: 1/50 for 1 hr |
| FITC-conjugated sheep anti-rabbit IgG | SIgma | F7512 | IF: 1/50 for 1 hr |
| Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse IgG | LI-COR | 926-80010 | WB: 1/50000 for 1 hr |
| HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG | LI-COR | 926-80011 | WB: 1/100000 for 1 hr |
| Vectorshield mounting medium with DAPI | Vector | H-1200 | Store at 4 C in the dark |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma | D6429 | Warm before use |
| Fibroblast growth medium | PromoCell | C-23010 | Warm before use, supplement with 50 µg / mL ascorbic acid |
| Phenol red-free DMEM | ThermoFisher | 21063-029 | Warm before use |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | T3924 | Warm before use |
| Gridded glass-bottomed dish | MatTek | P35G-2-14-C-GRID | |
| NH4OH, 28% – 30% solution | Sigma | 221228 | Dilute to 20 mM in de-ionised water. Once opened store in the dark, tightly capped. |
| Paraformaldehyde, 16 % solution | Alfa Aesar | 43368 | Dilute to 2 % (v/v) in PBS |
| Deoxycholic acid | Sigma | D2510 | Use at 2 % (v/v) final concentration |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Dilute to 0.5 % (v/v) final concentration |
| GelCode Blue stain reagent | ThermoFisher | 24590 | Protein stain for SDS-PAGE gels |
| Precision Plus protein standards | Biorad | 161-0374 | Protein standards for SDS-PAGE gels |
| Trans-Blot SD Semi Dry transfer cell | Biorad | 1703940 | Efficient transfer of high molecular weight proteins |
| PVDF transfer membrane | Millipore | ISEQ00010 | Immobilon-PSQ |
| Ponceau S stain | Sigma | P7170 | Reversible protein stain for PVDF membrane |
| WesternSure Enhanced chemiluminescence (ECL) substrate | LI-COR | 926-80200 | |
| High performance chemiluminescence film | GE Healthcare | 28906837 | |
| Sterile filtration unit, MILLEX-GV | Millipore | ML481051 | |
| SP8 AOBS confocal laser scanning microscope | Leica | Environmental chamber needed for temperature and CO2 control (Life Imaging Services) | |
| Key: IF, Immunofluorescence; WB, Western Blot |
References
- Bonnans, C., Chou, J., Werb, Z. Remodelling the extracellular matrix in development and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 786-801 (2014).
- Hynes, R. O., Naba, A. Overview of the matrisome–an inventory of extracellular matrix constituents and functions. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, a004903 (2012).
- Gross, J., Highberger, J. H., Schmitt, F. O. Extraction of Collagen from Connective Tissue by Neutral Salt Solutions. Proc Natl Acad Sci U S A. 41, 1-7 (1955).
- Hellewell, A. L., Adams, J. C. Insider trading: Extracellular matrix proteins and their non-canonical intracellular roles. Bioessays. 38, 77-88 (2016).
- Li, D., Yang, W., Li, G. Y. Extraction of native collagen from limed bovine split wastes through improved pretreatment methods. Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 83, 1041-1048 (2008).
- Strawich, E., Nimni, M. E. Properties of a collagen molecule containing three identical components extracted from bovine articular cartilage. Biochemistry. 10, 3905-3911 (1971).
- Kim, B. S., et al. Human collagen isolated from adipose tissue. Biotechnol Prog. 28, 973-980 (2012).
- Barallobre-Barreiro, J., Didangelos, A., Yin, X., Domenech, N., Mayr, M. A sequential extraction methodology for cardiac extracellular matrix prior to proteomics analysis. Methods Mol Biol. 1005, 215-223 (2013).
- Carter, W. G. Transformation-dependent alterations is glycoproteins of extracellular matrix of human fibroblasts. Characterization of GP250 and the collagen-like GP140. J Biol Chem. 257, 13805-13815 (1982).
- Sechler, J. L., Takada, Y., Schwarzbauer, J. E. Altered rate of fibronectin matrix assembly by deletion of the first type III repeats. J Cell Biol. 134, 573-583 (1996).
- Adams, J. C., Bentley, A. A., Kvansakul, M., Hatherley, D., Hohenester, E. Extracellular matrix retention of thrombospondin 1 is controlled by its conserved C-terminal region. J Cell Sci. 121, 784-795 (2008).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Hillenkamp, F., Karas, M. Mass spectrometry of peptides and proteins by matrix-assisted ultraviolet laser desorption/ionization. Methods Enzymol. 193, 280-295 (1990).
- Davis, M. T., et al. Automated LC-LC-MS-MS platform using binary ion-exchange and gradient reversed-phase chromatography for improved proteomic analyses. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 752, 281-291 (2001).
- Burnette, W. N. "Western blotting": electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Anal Biochem. 112, 195-203 (1981).
- Soucy, P. A., Werbin, J., Heinz, W., Hoh, J. H., Romer, L. H. Microelastic properties of lung cell-derived extracellular matrix. Acta Biomater. 7, 96-105 (2011).
- Hellewell, A. L., Gong, X., Scharich, K., Christofidou, E. D., Adams, J. C. Modulation of the extracellular matrix patterning of thrombospondins by actin dynamics and thrombospondin oligomer state. Biosci Rep. 35, (2015).
- Mumby, S. M., Abbott-Brown, D., Raugi, G. J., Bornstein, P. Regulation of thrombospondin secretion by cells in culture. J Cell Physiol. 120, 280-288 (1984).
- Myllyharju, J. Extracellular matrix and developing growth plate. Curr Osteoporos Rep. 12, 439-445 (2014).
- Roughley, P. J. Articular cartilage and changes in arthritis: noncollagenous proteins and proteoglycans in the extracellular matrix of cartilage. Arthritis Res. 3, 342-347 (2001).
- Naba, A., et al. The matrisome: in silico definition and in vivo characterization by proteomics of normal and tumor extracellular matrices. Mol Cell Proteomics. 11, M111 014647 (2012).
- Sanchez, P. L., et al. Acellular human heart matrix: A critical step toward whole heart grafts. Biomaterials. 61, 279-289 (2015).
