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Biology

A rápida, Método Scalable para o isolamento, estudo funcional, e Análise de matriz extracelular derivado de celular

Published: January 04, 2017
doi:
10.3791/55051
, ,
1School of Biochemistry,University of Bristol

Summary

The extracellular matrix plays a major role in defining the microenvironment of cells and in modulating cell behavior and phenotype. We describe a rapid method for the isolation of cell-derived extracellular matrix, which can be adapted to different scales for microscopic, biochemical, proteomic, or functional studies.

Abstract

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and pathological processes. However, the isolation of ECM, from tissues or cell culture, is complicated by the insoluble and cross-linked nature of the assembled ECM and by the potential contamination of ECM extracts with cell surface and intracellular proteins. Here, we describe a method for use with cultured cells that is rapid and reliably removes cells to isolate a cell-derived ECM for downstream experimentation.

Through use of this method, the isolated ECM and its components can be visualized by in situ immunofluorescence microscopy. The dynamics of specific ECM proteins can be tracked by tracing the deposition of a tagged protein using fluorescence microscopy, both before and after the removal of cells. Alternatively, the isolated ECM can be extracted for biochemical analysis, such as sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoblotting. At larger scales, a full proteomics analysis of the isolated ECM by mass spectrometry can be conducted. By conducting ECM isolation under sterile conditions, sterile ECM layers can be obtained for functional or phenotypic studies with any cell of interest. The method can be applied to any adherent cell type, is relatively easy to perform, and can be linked to a wide repertoire of experimental designs.

Introduction

Ao longo das últimas décadas, a matriz extracelular (ECM) tornou-se reconhecido como um ambiente diverso, dinâmico e complexo que está envolvido em processos celulares fisiológicos e patológicos múltiplos. Ao nível do tecido, o ECM influencia a sinalização celular, motilidade, diferenciação, angiogénese, biologia das células estaminais, tumorigénese, fibrose, etc. 1,2. O estudo da organização da ECM e processos dependentes de ECM, portanto, tem vastas implicações para a biologia celular e fisiologia do tecido. Para chegar a um entendimento mecanicista da composição ECM, organização e propriedades funcionais, os métodos para o isolamento precisa da ECM são obrigatórios. Considerando a primeira identificação de proteínas ECM invocados isolamento a partir de tecidos 3, a preparação de ECM a partir de células cultivadas tornou-se mais prevalente.

O isolamento e análise de ECM derivada de células é complicada por duas razões principais. Em primeiro lugar, a presença de células e oproteínas intracelulares abundantes IR pode torná-la difícil de isolar o ECM como uma estrutura extracelular discreta. De facto, algumas proteínas de ECM têm um papel no interior da célula, bem como na MEC 4; Portanto, a remoção eficiente de proteínas intracelulares a partir de ECM derivada de células é vital para que o estudo de proteínas da ECM não deve ser confundido com o seu papel no interior da célula. Em segundo lugar, o ECM derivada de células é composto por muitas proteínas oligoméricas, grandes, que são frequentemente covalentemente reticulado quando da montagem do ECM e que são, portanto insolúvel em detergentes convencionais. Estas propriedades podem complicar a extração ea análise mais aprofundada da ECM. Para resolver estes problemas, é necessário um método que permita a separação eficiente de proteínas de ECM de componentes celulares.

Vários métodos foram descritos na literatura para o isolamento de ECM a partir de qualquer cultura de células ou extractos de tecido. Muitos destes métodos são destinadas à extracção do PR ECM abundanteotein, o colagénio, a partir de tecidos e incluem a utilização de sais neutros, 3 5,6 condições ácidas, ou pepsina 7. Isolamento de ECM totais a partir de extractos de tecidos envolve frequentemente descelularização do tecido antes do isolamento do ECM. Por exemplo, um método de extracção sequencial tem sido descrito que isola ECM a partir de tecido cardíaco humano 8. Em primeiro lugar, as proteínas de ECM frouxamente ligados foram extraiu-se com NaCl 0,5 M antes de sulfato de dodecilo de sódio (SDS) foi utilizado para remover as células. Finalmente, as proteínas da MEC restantes foram extraídas com 4 M guanidina 8. ECM também podem ser solubilizados a partir de amostras descelularizados utilizando 8 M de ureia 9. Outras técnicas utilizam detergentes, tais como ácido desoxicólico 10, para extrair ambas as células e ECM antes de separar as proteínas da MEC insolúveis a partir do lisado celular por centrifugação solúvel.

O método para o isolamento e análise de ECM derivada de células descrito neste relatório proporciona uma Reproducible método para a remoção de material celular, deixando ECM derivada de células que podem ser analisados por imunofluorescência em situ ou extraído para análise bioquímica. Este método pode ser adaptado para qualquer tipo de células aderentes e podem ser ampliados para os procedimentos a jusante, tais como o immunoblotting, ou espectrometria de massa, ou para a utilização do ECM isolado em estudos funcionais. O método também pode ser usado em conjunto com microscopia confocal de células vivas para controlar a deposição de ECM de uma proteína marcadas de interesse em tempo real. Isto é conseguido através da utilização de um prato em grade, com fundo de vidro. No geral, a abordagem fornece um isolamento precisa da ECM derivado de células e também o escopo de identificar e monitorar a deposição e dinâmica de proteínas ECM individuais.

Protocol

1. remoção de células com Hidróxido de Amónio Solution Prepare células aderentes por plaqueamento na densidade adequada. NOTA: As células podem ser de qualquer tipo de células aderentes que produz ECM suficiente para análise. Aqui, nós descrevemos o uso de células COS-7, uma linha de células de macaco verde Africano rim do tipo fibroblastos, que contém sequências de ADN virais SV-40; RCS, uma linha celular de condrossarcoma de rato; ou fibroblastos normais da derme humana (HDF) cepas de prepúcio juvenil. HDF são utilizadas da passagem 1 a única passagem 8. Placa as células em lamelas para a imagem de células vivas e ECM, para estudos de microscopia de fluorescência de ECM fixo, ou para a preparação de ECM derivada da célula para ensaios funcionais de pequena escala. Placa as células em placas de cultura de células para análise SDS-PAGE, immunoblot ou estudos de proteómica. NOTA: As condições de cultura de células (número de células de placa e meio de cultura) vai depender do tipo de célula. O número de células de placa será necessárioser estabelecida empiricamente para a linha de células particular ou estirpe celular. Permitir um tempo adequado para que as células se depositam ECM, tipicamente> 16 h. NOTA: O período de tempo dependerá do tipo de célula e terá de ser determinada empiricamente. Se conduzir a expressão ectópica, permitir um tempo adequado para a expressão da proteína transfectadas de interesse e para a deposição de ECM. Em um exaustor, Prepare 20 mM de hidróxido de amónio Num recipiente adequado por diluição da solução mãe de 1/14 com deionizada H 2 O. Remover as células a partir do incubador e remover suavemente meio de cultura. Adicionar solução salina tamponada com fosfato (PBS) sem Ca2 + / Mg2 +, vertendo suavemente contra as paredes do prato. Balance o prato duas vezes e remover o líquido com uma pipeta de plástico. Repita duas vezes mais. Em um exaustor, inclinar cada prato e retire o PBS a partir do passo 1.2 com uma pipeta de plástico. Adicionar 3ml de hidróxido de amónio por 100 mm de prato e incubar à temperatura ambiente durante 5 min. Durante o período de incubação de 5 min, agitar suavemente o prato cada min para assegurar a lise de todas as células. Passos 1,4-1,7 também irá ser realizado no exaustor. NOTA: A remoção de células alternativo reagentes incluem 2 H ou 8 M de ureia, os quais são incubadas com as células durante 10 min. Adicionar grandes quantidades de desionizada H2O a cada prato, pelo menos, 20 ml por placa de 100 mm, com balanço. Elimine o hidróxido de amónio-solubilizado material que é composto de hidróxido de amónio, as células lisadas, e H 2 O desionizada-por aspiração com uma pipeta de transferência. Transferir esta solução resíduos em um recipiente para resíduos líquidos. Lava-se a camada de ECM insolúvel em copiosa H desionizada 2 O mais quatro vezes para assegurar a remoção completa de todo o material de hidróxido de amónio-solubilizado. Para o exame da ECM por imunofluorescência, corrigir o ECM por adição de 2%paraformaldeído (PFA; 3 mL por placa de 100 mm) à temperatura ambiente durante 10 min. Cuidado: PFA é muito perigoso em caso de pele ou contato com os olhos ea sobreexposição severa pode produzir danos nos pulmões, asfixia, inconsciência ou morte. Ele só deve ser tratado em um exaustor, e equipamento de protecção individual deve ser usado. Lave cada amostra fixa duas vezes com PBS, como no passo 1.2, e descartar a solução PFA em um recipiente de resíduos líquidos adequados. Se necessário, armazenar as amostras de ECM em PBS a 4 ° C antes de os preparar para a microscopia de fluorescência. 2. Acompanhamento de Deposição de uma proteína ECM por microscopia confocal de imagem de células vivas Contar as células sob um hemocitômetro. Para as células COS-7, placa 250.000 células num prato de cultura de células de 60 mm para a transfecção. NOTA: Para imagem de células vivas, as células devem ser transfectadas com um vector que codifica a proteína da MEC de interesse, fundido em estrutura com uma fluorescência geneticamente codificadotag nt. O objectivo é permitir a identificação da proteína ECM de interesse durante a geração de imagens de células vivas. Após um tempo adequado para a expressão de proteínas (por exemplo, 16 h) remover as células da placa com solução de tripsina-EDTA, contá-los num hemocitómetro, e a placa de ~ células 150.000 numa placa de 35 mm em grade, com fundo de vidro para imagiologia. Permitir 2 h para as células para recolocar e para começar a deposição de ECM (o período de tempo dependerá do tipo de célula e deve ser estabelecida empiricamente). NOTA: Use um meio celular que não contém vermelho de fenol, pois isso pode dar uma coloração avermelhada que afeta a qualidade da imagem. Durante o período de 2 h acima, configurar um microscópio confocal com uma câmara incubadora a 37 ° C e um fornecimento de CO 2. Permitir que a temperatura na câmara e no prato para estabilizar a 37 ° C antes de imagem; isso pode levar até 1 h. Incubar as células plaqueadas sobre os 35 mm prato em grade, com um marcador fluorescente de células durante 30 min. Em seguida, lavar as célulasfenol duas vezes em meio de cultura livre de vermelho antes da imagiologia. NOTA: um marcador fluorescente citoplasmático pode ser usado para visualizar os volumes de células, ou um marcador de incorporação de membrana pode ser utilizado para visualizar as bordas de células. Usando o objectivo de 20X e de contraste de fase em um microscópio confocal, identificar um quadrado da grelha apropriada que contém um número (> 3) de aderentes, as células saudáveis. Confirmar a expressão da proteína alvo de escolha nas células dentro do quadrado da grelha seleccionada, utilizando os objectivos 63X ou 100X e os comprimentos de onda apropriados sob microscopia de fluorescência. Configurar fluorescência e de contraste de fase de imagens de lapso de tempo usando um software z-stack. Defina o "começar" pilha para ser apenas abaixo da camada de ECM ea pilha "End" para ser um pouco acima do corpo celular. Definir o tamanho Z-passo a 0,3 uM e a Z-de volume entre 5 um e 10 um de profundidade no total, dependendo do tipo de célula. Isto lhe dará entre 15-30 z-seções por ponto de tempo. Capture fluorescência (para a proteína fluorescente vermelha (RFP), excitação = 555 nm e emissão = 584 nm) e imagens de contraste de fase periodicamente durante um período de tempo definido. Por exemplo, use o software de lapso de tempo para definir o intervalo de tempo de 2 minutos e a duração de 2 horas. Selecione o botão "iniciar" para começar a captura de imagens de seção z ao longo do período de tempo definido. No final do período de tempo, remover as células do prato, tal como descrito nos passos 1,1-1,5, para confirmar a localização da proteína marcadas com fluorescência de interesse no ECM. Use imagens de contraste de fase e o objetivo 20X para realocar o quadrado da grelha relevante. Mudar para o objetivo 63X e identificar a camada ECM sob microscopia de fluorescência. Compare esta imagem com a imagem de pré-extracção 3. Preparação estéril de ECM derivados de celular para celular ensaios funcionais Cresça uma população de células (as células "produtores Matrix") em lamelas e outra popumento (o "teste") em cultura de células padrão em um prato de cultura de células de 100 milímetros durante pelo menos 24 h. NOTA: Estes podem ser quaisquer dois tipos de células aderentes diferentes, eo delineamento experimental pode incluir a transfecção de populações um ou ambos os celulares para expressar uma proteína ECM fluorescente-marcadas. Em uma câmara de fluxo laminar, tal como utilizado para a cultura de células, preparação de soluções estéreis de PBS sem Ca2 + / Mg2 +, hidróxido de amónio 20 mM (ver passo 1.3), e desionizada H 2 O, passando cada um através de um filtro estéril de 0,2 uM filtro para um recipiente esterilizado apropriado. Manutenção técnica estéril, lavar cuidadosamente as células "de produtores de matriz" em lamelas três vezes com PBS estéril (veja o passo 1.2). Remover o PBS por aspiração com uma pipeta estéril e eliminá-lo em um recipiente de resíduos líquidos adequados. Adicionar 20 mM de hidróxido de amónio estéril (3 mL / prato de 100 milímetros) e incubar durante 5 minutos com agitação em intervalos. Adicionar quantidades copiosasde estéril H de-ionizada 2 O para o prato "produtor de matriz", pelo menos 20 ml por placa de 100 mm, com balanço e deitar fora o lisado celular em um recipiente de resíduos adequado. Repetir o passo 3.5 por mais quatro vezes para assegurar a remoção completa do material de hidróxido de amónio-solubilizado. NOTA: O ECM depositados pelas células "de produtores de matriz" sobre as lamelas em seguida, fornece uma ECM estéril para ensaios funcionais com quaisquer células de teste de interesse. Incubar as células de teste a partir da reserva de células prato com 1,5 mL de solução de tripsina-EDTA por placa de 100 mm (0,05% w / v de tripsina e 0,02% w / v de EDTA em solução salina equilibrada de Hank), até que as células de teste são separadas do prato . Adicionar meio de células, as células de teste centrifugar a 400 xg durante 5 min, e remover o líquido sobrenadante. Volte a suspender as células de teste em meio fresco, estéril e contá-los em um hemocitômetro. Placa de um número adequado dessas células de teste para a estéril ECM, isolado no coverslips. Cultura-los no meio celular apropriado durante 2-3 h, ou durante o período de tempo necessário para a concepção experimental. Para examinar a organização do citoesqueleto de actina, fixar as células de ensaio em 2% de PFA e manchar os com isotiocianato de fluoresceína (FITC) -phalloidin (excitação = 490 nm e emissão = 525 nm) para visualizar F-actina e com 4 ', 6 -diamidino-2-fenilindole (DAPI; excitação = 358 nm e emissão = 461 nm) para visualizar os núcleos 11. NOTA: Comparar a morfologia e organização da actina nas células de teste semeadas em ECM derivada da célula heteróloga com células de teste banhado em seu próprio ECM. 4. Isolamento de ECM para SDS-PAGE, Análise de imunotransferência, ou Proteomics Crescer as células aderentes de interesse em placas de 100 mm de cultura de células (5 a 10 pratos para proteómica ou 1-2 pratos para imunoblotting) por 24-96 h, conforme apropriado para o tipo de célula, e para permitir a secreção de deposição de ECM. Remover as células como described em passos 1,1-1,5. Inclinação cada placa em um ângulo para drenar residual H 2 O para a parte inferior do prato, e cuidadosamente remover qualquer remanescente H 2 O com uma pipeta de P200 até que a placa está completamente seco. Em paralelo, o tampão de amostra de SDS-PAGE de calor contendo ditiotreitol 100 mM (DTT) a 95 ° C durante 2 min, utilizando um bloco de aquecimento, e em seguida adicioná-lo à placa. 200 ul de tampão de amostra por cada placa de 100 mm são adequados para as amostras a serem examinadas por imunotransferência. Para analisar ECM por espectrometria de massa, obter uma amostra mais concentrada recolhendo o tampão de amostra de SDS-PAGE do prato (como descrito nas etapas 4.5 e 4.6, abaixo), re aquecendo-lo a 95 ° C, e utilizando a mesma aliquota através 2-3 placas adicionais. Use um raspador de células para raspar completamente o ECM fora do prato, garantindo que todas as áreas do prato foram raspados. Com o raspador de células, recolher a amostra de um lado do prato e removê-lo com um 200mL ponta da pipeta em um tubo. Transferir todo o SDS-PAGE de extracto de tampão de amostra residual da ponta do raspador de células para dentro do tubo para minimizar a perda de material de ECM. Para uma amostra concentrada, re-aquecer o mesmo SDS-PAGE tampão de amostra alíquota para 95 ° C e re usar-lo em toda 2-3 placas adicionais. Resolver as proteínas da MEC por SDS-PAGE a 12, usando 7% ou 4-7% de gel de poliacrilamida de gradiente. NOTA: É conveniente usar marcadores de proteína pré-manchados. Para aumentar a resolução das proteínas da MEC elevado peso molecular, prolongar o tempo de gel de funcionamento de tal modo que o marcador de peso molecular de 37 kDa é executado perto do fundo do gel e marcadores de peso molecular <37 kDa ter executado fora do gel. Para análise proteômica das proteínas da MEC, manchar o gel com uma mancha de proteína e capturar uma imagem. Cortar bandas de interesse a partir do gel, os digerir com tripsina, e analisá-las por dessorção de laser assistida pela matriz / ionização (MALDI) Espectrometria de -massa <sup> 13. Alternativamente, para uma análise mais abrangente do extrato ECM e analisar toda a amostra, cortar a faixa de gel em seções, digeri-los com tripsina, e realizar a espectrometria de cromatografia de massa líquida (LC-MS) 14. Alternativamente, por imunotransf erência 15, a transferência de proteínas do gel de SDS-PAGE em fluoreto de vinilideno (PVDF) da membrana de polivinilideno a 15 V durante pelo menos 1 h 10 min (método semi-seca) para assegurar a transferência das proteínas da MEC elevado peso molecular . Visualizar a proteína total transferido para a membrana com Ponceau S a uma mancha. A seguir ao passo 4.11, utilizar anticorpos para determinar a presença e / ou fazer uma análise semi-quantitativa das proteínas da MEC individuais 15. Bloquear a membrana com 2% (w / v) de leite em TBS-Tween 20 (tampão de bloqueio) durante a noite a 4 ° C. Dilui-se anticorpos específicos para proteínas de ECM em tampão de bloqueio e incubar com a membrana durante 1,5 h à temperatura ambiente (anticorpo de fibronectin diluída 1/600 e anticorpo para trombospondina-1 diluída 1/150; Tabela Suplementar 1). Testar a qualidade do isolamento ECM por re-sondagem da mesma mancha com anticorpos contra proteínas intracelulares abundantes, tais como actina ou tubulina (anti-actina diluído a 1 / 10.000 e anti-tubulina diluído a 1 / 5.000).

Representative Results

O protocolo descrito nos passos 1,1-1,5 atos para remover as células e deixar para trás a ECM derivada da célula. O protocolo foi realizado em células COS-7 cultivadas durante 96 h em lamelas de vidro, e o ECM derivada de células foi analisada por microscopia de fluorescência. O tratamento com hidróxido de amónio removidos de forma eficaz as células, tal como estabelecido pela perda dos núcleos das células e do citoesqueleto de actina, de acordo com DAPI e coloração com faloidina, respectivamente (Figura 1). A extracção das células com 2 M de ureia não era tão eficaz como o hidróxido de amónio; vestígios de DAPI e coloração faloidina foram detectados após o tratamento. 8 M de ureia teve um efeito semelhante ao de hidróxido de amónio (Figura 1). Em seguida, o ECM derivada de células foi visualizado antes e após o tratamento com hidróxido de amónio (passos 2,1-2,11). Células COS-7 foram transfectadas com uma proteína fluorescente vermelha monomérica (MRFP) tagged trímero trombospondina-1 C-terminal, (mRFPovTSP1C) 11 e cultivadas em um prato de 35 mm, com uma base de vidro em grade. Duas horas após a galvanização, um quadrado da grelha adequada que continham células saudáveis ​​vários expressando mRFPovTSP1C foi visualizado sob um microscópio confocal. Uma imagem de contraste de fase de referência foi feita desta área, e, em seguida, imagens de fluorescência de lapso de tempo foi realizada a cada 1 min para 2 h (Figura 2A). As células foram, em seguida, removido utilizando hidróxido de amónio, e o mesmo quadrado da grelha sobre o prato foi transferido sob contraste de fase e, em seguida, re-analisadas por microscopia de fluorescência. As células não eram mais presente no quadrado da grelha, mas mRFPovTSP1C permaneceu dentro do ECM, detectadas por microscopia de fluorescência como pontos lacrimais característica (Figura 2A). Qualquer mRFPovTSP1C depositado na ECM antes da remoção de células foi identificado por comparação do padrão de fluorescência pré e pós-remoção de células. O ponto lacrimal fluorescente identificada em ambas as imagens (Figure 2A, exemplo seta) são inferidos a ser associada com o ECM. tratamento com hidróxido de amónio foi então usado para isolar o ECM nativa a partir de células cultivadas, aderentes. fibroblastos dérmicos humanos (HDF) foram cultivadas em lamelas de vidro durante 96 h. As células foram removidas utilizando hidróxido de amónio, e o ECM foi sondada com um anticorpo anti-colagénio I, que demonstraram uma fibrilar e coloração malha padrão característico 16 (Figura 2B). A fibronectina foi examinada a padronização, em torno de células não-permeabilizadas fixadas de condrossarcoma de rato (RCS) e dentro do ECM após a remoção das células de RCS (Figura 2C). O isolamento de hidróxido de amónio de ECM foi também levada a cabo sob condições estéreis de modo a que as células de "teste" poderia ser re-plaqueadas em ECM para fenotípica ou estudos funcionais. Por exemplo, "test" células COS-7 foram plaqueadas durante 2 horas para ECM estéril produzido por células de RCS, e tgalinha que foram fixadas, permeabilizadas, e analisados para a organização de actina F por coloração com faloidina-FITC, em comparação com células COS-7 que produzem o seu próprio ECM (passos 3,1-3,9) (Figura 3). Numa escala maior, o método foi utilizado para isolar por procedimentos bioquímicos ECM. Por exemplo, as células RCS foram cultivadas em duas placas de cultura de células de 100 mm, durante 7 dias, e os procedimentos em etapas 4,1-4,7 foram seguidos. As proteínas da MEC derivada de células foram recolhidas por raspagem-los em tampão de amostra de SDS-PAGE a quente e foram separadas por SDS-PAGE num gel de poliacrilamida a 7% sob condições redutoras. O gel foi corado para a proteína, e as quatro bandas principais foram cada isolado e analisado por espectrometria de massa (Figura 4A). Um certo número de proteínas de ECM, incluindo fibronectina, trombospondina 1 (TSP1), trombospondina proteína 5 / cartilagem oligomérico matriz (TSP5 / COMP), e matrilin-1 foram identificados (Figura 4B). Em alternativa, preparações de pequena escala de ECM pode ser avaliada por imunocolorações. Por exemplo, o ECM derivada de células a partir de células COS-7 que expressam ectopicamente mRFPovTSP1C foi separada por SDS-PAGE, transferidas para uma membrana de PVDF e sondadas quanto a RFP com um anticorpo anti-RFP (Figura 4C). Esta técnica é sensível o bastante para detectar diferenças na deposição de entre um trímero nativa de TSP1 (mRFPovTSP1C) e uma Engineered pentâmero da região C-terminal de TSP1 (MRFP-TSP-5-1C) 17 (Figura 4C). Para investigar o ECM endógena de HDF, a presença de proteínas específicas no lisado celular ou a ECM isolado foi analisado por imunotransf erência. A característica de proteínas de ECM fibronectina e trombospondina-1 foi detectado na matriz extracelular, enquanto que os abundantes proteínas intracelulares α-tubulina e β-actina estavam ausentes da ECM isolado (Figura 4D). <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = "1"> Figura 1: Comparação de métodos de remoção de celular. células COS-7 foram crescidas a uma densidade elevada durante 96 h, em lamelas fixados em 2% de PFA, e permeabilizadas em Triton X100 a 0,5%, ou foram tratadas como indicado para a remoção de células. As lamelas foram depois coradas com FITC-faloidina para visualizar a F-actina e DAPI para visualizar núcleos. Barra de escala = 25 um. Este valor é modificado de uma publicação original no Journal of Cell Science 11. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2: Identificação de ECM proteínas no Isolated ECM. (A) de contraste de fase e fluorescência imagens decélulas COS-7 que expressam mRFPovTSP1C e cultivadas em um prato de 35 mm, com, uma base em grelha com fundo de vidro durante 2 h. As imagens são mostradas antes e após a remoção das células por hidróxido de amónio. A aresta da carta de grade é indicado nas imagens de contraste de fase com uma linha pontilhada. setas brancas indicam exemplos de puncta fluorescente que estavam presentes antes e depois da remoção das células. (B) Detecção de colágeno I em HDF ECM por imunofluorescência indireta. HDF foram cultivadas durante 96 h, e removido com hidróxido de amónio, e o ECM foi corado para I. colagénio fibrilar humano O ECM também foi corado com o anticorpo secundário anti-coelho conjugado com FITC sozinho. (C) A localização de fibronectina em torno de células RCS ou dentro isolado RCS ECM, tal como detectado por imunofluorescência indirecta. células RCS foram cultivadas durante 48 h, fixadas em 2% de PFA, e coradas para a fibronectina e com DAPI. Em pratos paralelos, as células foram removidas com hidróxido de amónio a 20 mM e o ECM foi corado para FIBRonectin e com DAPI. As células foram também coradas com FITC-conjugado anti-IgG de rato anticorpo sozinho. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3: O uso de estéril ECM para estudos funcionais. "matriz" de produtores células RCS foram cultivadas durante 48 h em lamelas de vidro e, em seguida, tratada com hidróxido de amónio a 20 mM sob condições estéreis para remover as células. Células COS-7 "de teste" foram plaqueadas em lamelas com ou sem isolado RCS ECM durante 2 h, fixadas em 2% de PFA, permeabilizadas em 0,5% de Triton X100, e coradas com FITC-faloidina para visualizar a F-actina e DAPI para visualizar núcleos . COS-7 células semeadas em RCS ECM espalhar mais amplamente e formaram grandes feixes microfilamentosas (exemplo seta) e Ruff bordales. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4: Identificação de proteínas de ECM isolada por SDS-PAGE, espectrometria de massa, ou imunotransferência. Células de RCS (A) foram cultivadas durante 7 dias e removido com hidróxido de amónio a 20 mM; o ECM foi raspada para cima em tampão de amostra de SDS-PAGE quente contendo DTT 100 mM. A preparação de ECM foi separada por SDS-PAGE num gel de poliacrilamida a 7% sob condições redutoras. Quatro bandas significativas (setas 1-4) foram identificados por coloração da proteína. (B) As proteínas de ECM RCS faixas 1-4 foram identificados por espectrometria de massa MALDI. (C) células COS-7 que expressam quer mRFPovTSP1C (trímero) ou MRFP-TSP-5-1C (pentâmero) foram cultivadas durante 48h e removido com hidróxido de amónio a 20 mM, e o ECM foi isolado em tampão de amostra de SDS-PAGE a quente contendo DTT 100 mM. A preparação de ECM foi separada por SDS-PAGE num gel de poliacrilamida a 7% sob condições redutoras, transferidos para uma membrana de PVDF e sondadas com um anticorpo anti-RFP. Este painel é modificado de uma publicação original em Bioscience Reports 17. (D) de HDF foram cultivadas durante 96 h e, em seguida, tratados com ácido desoxicólico a 2% em PBS (ligado celular) ou com hidróxido de amónio a 20 mM para remover as células. O ECM foi raspadas para tampão de amostra SDS-PAGE quente. As duas fracções foram separadas por SDS-PAGE num gel de poliacrilamida a 10% sob condições redutoras, transferidos para uma membrana de PVDF e sondado com anticorpos, tal como indicado. Em cada painel, as posições dos marcadores de peso molecular são indicados em kDa. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Passos críticos dentro do Protocolo

O método tem alguns passos críticos que devem ser seguidas para garantir o isolamento bem sucedido e análise de ECM. Por exemplo, o hidróxido de amónio for utilizado para remover as células e para isolar ECM para análise. Apesar de hidróxido de amónio é estável em soluções aquosas no escuro e pode ser armazenada à temperatura ambiente, as garrafas devem ser firmemente re-selado entre cada utilização. Como o gás pode evaporar-se a partir da solução, diminuindo assim a concentração, é altamente recomendável iniciar uma garrafa fresca a cada 6-8 semanas. Além disso, a solução de trabalho deve ser feito de fresco para cada experiência. É também essencial que as células são totalmente removida com lavagens copiosas de água desionizada. Se essas etapas não são executadas de forma adequada, o material celular pode permanecer no prato e contaminar análises a jusante. Se as células foram cultivadas durante 10 dias ou mais, podem ser necessárias as lavagens adicionais de água. É importante nota que a camada de ECM isolado é tipicamente muito fino em comparação com as células 11, de modo que é necessário cuidado quando identificando o ECM durante a imagem. Para a extracção eficaz do ECM isolado em tampão de amostra de SDS-PAGE, é essencial que o tampão de amostra contém um agente de redução. Para a remoção mais eficaz do ECM, fervendo-quente tampão de amostra deve ser usado. Para as experiências em que amostras da MEC vai ser resolvidos por electroforese em SDS-PAGE para coloração de proteína ou proteómica, é crítico para conseguir uma amostra concentrada por raspagem várias placas-vale de ECM na mesma aliquota de tampão de amostra.

Modificações e resolução de problemas

A produção e a secreção de proteínas da MEC pode variar significativamente entre os tipos de células, de modo que os períodos de tempo para a secreção e a deposição de ECM deve ser determinado de novo para cada tipo de célula. Também é importante estar ciente de que a composição ECM irá alterar dinamicamente em relação to densidade celular e tempo em cultura 18. Este factor deve ser tido em conta na concepção de experiências. Claramente, a selecção de um tipo de célula para este método é importante, particularmente quando se extrai o ECM para análise por espectrometria de massa, que pode necessitar de uma quantidade substancial de proteína total ECM.

Limitações da técnica

As células que segregam níveis muito baixos de proteínas da MEC vai ser mais difícil para utilização com este método. As células não aderentes, as culturas de células em 3D, ou ensaios de invasão de células são inadequados actualmente para o isolamento de ECM por este método. O método é mais adequado para uso com culturas de células "2-dimensional" padrão. Uma vez que a extracção de hidróxido de amónio remove as células completamente, ECM associados com os lados superiores das células e segregadas, mas não reticulados, proteínas de ECM são também removidos, deixando no prato de uma camada fina de ECM montado a partir de baixo e em torno das bases das células 11,17 </sup>. É difícil de quantificar a quantidade de ECM é libertado pela extracção de hidróxido de amónio, porque o material libertado também inclui proteínas de ECM que são intracelulares, quer antes ou após a secreção de absorção da superfície da célula.

Importância da Técnica em Matéria de Existentes / Métodos Alternativos

A capacidade de realizar uma vasta gama de experiências com ECM isolado é importante no contexto da biologia celular e fisiologia do tecido, e também tem implicações para os campos da regeneração de tecidos e a engenharia de tecidos. O método tem vantagens sobre os géis formados a partir de colagénios purificados ou outras proteínas de ECM purificados em que as células montar estruturas ECM complexos na sua dimensão nativa, com mecanismos de reticulação nativas e com as proteínas de ECM individuais presentes em proporções adequadas para o tipo de célula de origem. Por exemplo, o estudo de proteômica de RCS ECM demonstrado matrilins abundantes e COMP / TSP5, como esperado paraum ECM cartilaginoso 19,20 (Figura 4). Em geral, a análise de ECM derivada de células é dificultada pela sua natureza de uma extensa rede de multi-proteínas, que resulta em reticulação covalente e a insolubilidade das muitas proteínas da MEC, e também por o potencial de contaminação dos extrai o ECM com as proteínas intracelulares. Um processo multi-passo concebido para isolar a fracção de ECM de tecidos para análise proteomic rendeu 8% de proteínas da MEC no conjunto total de proteínas identificadas 21. No entanto, os péptidos de proteínas de ECM foi de 73% do total de péptidos identificados. Este método para o isolamento e análise de ECM derivada de células rapidamente e com fiabilidade remove material celular mantendo proteínas da MEC. Este método pode ser usado para uma variedade de tipos de células e aplicações a jusante e facilita a análise de biologia ECM e célula-ECM interacções em cultura de células. Os nossos protocolos detalhe como o método pode ser aplicado em diferentes escalas para tratar uma vasta gama de expperguntas erimental no que respeita à organização ECM, dinâmica, ou composição, e os efeitos funcionais de ECM isolado nas células.

Aplicações futuras ou chegar depois de dominar esta técnica

Olhando para o futuro, o método poderia ser adaptado para uso com culturas de células em 3D; isso iria expandir a sua relevância fisiológica. Tecido descelularizado nativa tem um grande potencial como um andaime para a regeneração do tecido perdido ou danificado e, como uma alternativa ao transplante, tais como insuficiência cardíaca após 22. Tem o potencial para ultrapassar os problemas de disponibilidade de doador e immunorejection. As aplicações futuras do método descrito neste relatório pode investigar a sua utilização com culturas de células ou em 3D descelularização de tecidos, que iria aumentar ainda mais o âmbito desta abordagem.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Estamos muito gratos ao Dr. Belinda Willard, proteômica e metabolômica Laboratory, Instituto de Pesquisa Lerner, Cleveland Clinic, para realizar a análise proteômica de RCS ECM. Agradecemos o apoio financeiro da theMedical Conselho Research UK, conceder número K018043, a JCA.

Materials

Antibody to COL1A1 Novus NB600-408 Rabbit polyclonal. Reacts with other fibrillar collagens as well as collagen I.  IF:  1/200 
Antibody to fibronectin Sigma F3648 Rabbit polyclonal. WB: 1/600 for 1.5 hr. IF: 1/200
Antibody to thrombospondin 1  ThermoFisher  MA5-13398 Mouse monoclonal clone A6.1.  WB: 1/150 for 1.5 hr
Antibody to RFP Abcam ab62341 Rabbit polyclonal. WB: 1/2000 for 2 hr
Antibody to β-actin Sigma A1978 Mouse monoclonal clone AC-15. WB: 1/10000 for 1.5 hr 
Antibody to α-tubulin Sigma T9026 Mouse monoclonal clone DM1A. WB: 1/5000 for 1.5 hr
Cell Tracker Green ThermoFisher  C2925 Fluorescent cell marker. Use at 1 µM for 30 min
Fluorescein isothiocyanate (FITC)-Phalloidin Sigma P-5282 Stock = 50mg/ml in DMSO.1/50 for 45 min
FITC-conjugated goat anti-mouse IgG Sigma F8771 IF: 1/50 for 1 hr
FITC-conjugated sheep anti-rabbit IgG SIgma F7512 IF: 1/50 for 1 hr
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse IgG LI-COR 926-80010 WB: 1/50000 for 1 hr
HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG LI-COR 926-80011 WB: 1/100000 for 1 hr
Vectorshield mounting medium with DAPI Vector H-1200 Store at 4 C in the dark
Dulbecco's Modified Eagle's Medium Sigma D6429 Warm before use
Fibroblast growth medium PromoCell C-23010 Warm before use, supplement with 50 µg / mL ascorbic acid
Phenol red-free DMEM ThermoFisher  21063-029 Warm before use
Trypsin-EDTA solution Sigma T3924 Warm before use
Gridded glass-bottomed dish MatTek P35G-2-14-C-GRID
NH4OH, 28% – 30%  solution Sigma 221228 Dilute to 20 mM in de-ionised water. Once opened store in the dark, tightly capped. 
Paraformaldehyde, 16 % solution Alfa Aesar 43368 Dilute to 2 % (v/v) in PBS
Deoxycholic acid Sigma D2510 Use at 2 % (v/v) final concentration
Triton X-100 Sigma T8787 Dilute to 0.5 % (v/v) final concentration
GelCode Blue stain reagent ThermoFisher  24590 Protein stain for SDS-PAGE gels
Precision Plus protein standards Biorad 161-0374 Protein standards for SDS-PAGE gels
Trans-Blot SD Semi Dry transfer cell Biorad 1703940 Efficient transfer of high molecular weight proteins
PVDF transfer membrane Millipore ISEQ00010 Immobilon-PSQ 
Ponceau S stain Sigma P7170 Reversible protein stain for PVDF membrane
WesternSure Enhanced chemiluminescence (ECL) substrate LI-COR 926-80200
High performance chemiluminescence film GE Healthcare 28906837
Sterile filtration unit, MILLEX-GV Millipore ML481051
SP8 AOBS confocal laser scanning microscope Leica Environmental chamber needed for temperature and CO2 control (Life Imaging Services)
Key: IF, Immunofluorescence;
WB, Western Blot
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References

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Hellewell, A. L., Rosini, S., Adams, J. C. A Rapid, Scalable Method for the Isolation, Functional Study, and Analysis of Cell-derived Extracellular Matrix. J. Vis. Exp. (119), e55051, doi:10.3791/55051 (2017).
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