מהיר, שיטת Scalable עבור הבידוד, הלימוד פונקציונלי, וניתוח של מטריקס תאים שמקורם
Summary
The extracellular matrix plays a major role in defining the microenvironment of cells and in modulating cell behavior and phenotype. We describe a rapid method for the isolation of cell-derived extracellular matrix, which can be adapted to different scales for microscopic, biochemical, proteomic, or functional studies.
Abstract
The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and pathological processes. However, the isolation of ECM, from tissues or cell culture, is complicated by the insoluble and cross-linked nature of the assembled ECM and by the potential contamination of ECM extracts with cell surface and intracellular proteins. Here, we describe a method for use with cultured cells that is rapid and reliably removes cells to isolate a cell-derived ECM for downstream experimentation.
Through use of this method, the isolated ECM and its components can be visualized by in situ immunofluorescence microscopy. The dynamics of specific ECM proteins can be tracked by tracing the deposition of a tagged protein using fluorescence microscopy, both before and after the removal of cells. Alternatively, the isolated ECM can be extracted for biochemical analysis, such as sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoblotting. At larger scales, a full proteomics analysis of the isolated ECM by mass spectrometry can be conducted. By conducting ECM isolation under sterile conditions, sterile ECM layers can be obtained for functional or phenotypic studies with any cell of interest. The method can be applied to any adherent cell type, is relatively easy to perform, and can be linked to a wide repertoire of experimental designs.
Introduction
במהלך העשורים האחרונים, תאי מטריקס (ECM) הפך מוכר בסביבה מגוונת, דינאמית, ומורכב כי הוא מעורב מספר תהליכים בתא-פיזיולוגיים ופתולוגיים. ברמת הרקמה, ECM משפיעה תא איתות, תנועתיות, בידול, אנגיוגנזה, גזע ביולוגיה של תא, tumorigenesis, סיסטיק, וכו '1,2. המחקר של ארגון ECM ותהליכים תלויי ECM ולכן יש השלכות רחבות על ביולוגיה של התא ופיזיולוגיה רקמות. כדי להגיע להסכם בנות מכניסטית של רכב ECM, ארגון תכונות פעילות, שיטות הבידוד המדויק של ECM נדרשות. בעוד זיהוי המוקדם של חלבוני ECM לסמוך עליו בידוד מרקמות 3, הכנת ECM מ תאים בתרבית עכשיו הפכה נפוצה יותר.
הבידוד והניתוח של ECM תאים שמקורם הוא מסובך משתי סיבות עיקריות. ראשית, הנוכחות של תאים ואתחלבונים תאיים ir בשפע יכולים לעשות את זה קשה לבודד את ECM כמבנה תאי בדיד. ואכן, כמה חלבונים ECM יש תפקידים בתוך התא כמו גם ב ECM 4; ולכן, ההסרה היעילה של חלבונים תאיים מ ECM תאים שמקורם היא חיונית אם המחקר של חלבונים בתוך ECM הוא לא להתבלבל עם התפקידים שלהם בתוך התא. שנית, ECM תאים שמקורם מורכב חלבונים גדולים, oligomeric רבים, אשר לעתים קוולנטית צולב על הרכבת ECM ולכן הם מסיסי דטרגנטים סטנדרטיים. מאפיינים אלה יכולים לסבך חילוץ ואת הניתוח הנוסף של ECM. כדי לטפל בבעיות אלה, שיטה נדרשת המאפשרת הפרדה היעילה של חלבוני ECM מ מרכיבים תאיים.
מספר שיטות תוארו בספרות עבור הבידוד של ECM מתרבה או תא או תמציות רקמה. רבי השיטות אלה מכוונים החילוץ של יחסי ציבור ECM בשפעotein, קולגן, מרקמות וכוללים את השימוש במלחים נייטרלי 3, בתנאים חומציים 5,6, או פפסין 7. בידוד של ECM הכולל מתמציות רקמות כרוך לעתים קרובות decellularization של הרקמה לפני הבידוד של ECM. לדוגמא, שיטת חילוץ רציפה תואר המבודדת ECM מרקמות לב אנושיות 8. ראשית, חלבונים ECM-המרופט חולצו עם 0.5 M NaCl לפני סולפט dodecyl נתרן (SDS) שימש כדי להסיר את התאים. לבסוף, חלבוני ECM שנותרו חולצו באמצעות 4 M guanidine 8. ECM ניתן solubilized גם מדגים decellularized באמצעות 8 אוריאה ז 9. טכניקות אחרות להשתמש בחומרי ניקוי, כגון חומצת deoxycholic 10, כדי לחלץ שני תאי ECM לפני פרידת חלבוני ECM מסיסים מן lysate התא המסיס על ידי צנטריפוגה.
השיטה לבידוד וניתוח של ECM תאים שמקורם שתוארו בדו"ח זה מספק reproשיטת ducible להסרת חומר התא, משאיר ECM תאים שמקורם כי ניתן לנתח על ידי ב immunofluorescence באתרו או חילוץ לאנליזה ביוכימית נוספת. שיטה זו ניתן להתאים לכל סוג תא חסיד וניתן לשנותם לפייסבוק נהלים במורד זרם, כגון immunoblotting או ספקטרומטריית מסה, או לניצול של ECM המבודד במחקרים פונקציונליים. השיטה יכולה לשמש גם בשילוב עם מיקרוסקופיה confocal של תאים חיים לעקוב בתצהיר ECM של חלבון מתויג עניין בזמן אמת. זו מושגת באמצעות שימוש צלחת gridded, תחתית זכוכית. בסך הכל, הגישה מספקת בידוד מדויק של ECM תא הנגזרות וגם ההיקף לזהות ולנטר בתצהיר ודינמיקה של חלבוני ECM פרט.
Protocol
Representative Results
Discussion
צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול
יש השיטה כמה שלבים קריטיים שיש אחריו על מנת להבטיח את הבידוד המוצלח וניתוח של ECM. לדוגמא, אמוניום הידרוקסיד משמש כדי להסיר את התאים לבודדים ECM לניתוח. למרות אמוניום הידרוקסיד יציב בתמיסות מימיות בחושך ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר, בקבוקי חייב להיות בחוזקה מחדש חתום בין כל שימוש. בגלל הגז עשוי להתאדות מהפתרון, ובכך להקטין את הריכוז, אנו ממליצים בחום החל בקבוק חדש כל 6-8 שבועות. בנוסף, הפתרון עובד צריך להיעשות טרי עבור כל ניסוי. כמו כן הוא חיוני כי התאים יוסרו לחלוטין עם שטיפות שופעות במי דה מיונן. אם צעדים אלה לא מבוצעים כראוי, חומר הסלולר עשוי להיותר על הצלחת ולזהם ניתוחים במורד זרם. אם התאים כבר גדל במשך 10 ימים או יותר, שטיפות מים נוספים ייתכן שיהיה צורך. חשוב nOTE ששכב ECM המבודד היא בדרך כלל רזה מאוד בהשוואה לתאים 11, כך טיפול נחוץ בעת זיהוי ECM במהלך הדמיה. לקבלת מיצוי יעיל של ECM המבודד למאגר מדגם SDS-PAGE, זה הכרחי כי חיץ המדגם מכיל סוכן צמצום. למען הסר היעיל ביותר של ECM, חיץ מדגם רותחים-חם יש להשתמש. בניסויים בהם דגימות ECM תיפתר על ידי אלקטרופורזה SDS-PAGE מכתים חלבון או פרוטאומיקה, היא קריטית כדי להשיג מדגם מרוכז על ידי גירוד כמה צלחות בשווי של ECM לאותו aliquot של חיץ מדגם.
שינויים ופתרון בעיות
ייצור הפרשת חלבוני ECM יכולים להשתנות באופן משמעותי בין סוגי תאים, כך תקופות זמן הפרשה בתצהיר של ECM צריכות להיקבע דה נובו עבור כל סוג תא. כמו כן, חשוב להיות מודע לכך רכב ECM ישתנה באופן משמעותי ביחס to תא צפיפות וזמן בתרבות 18. גורם זה יש לקחת בחשבון בעת תכנון ניסויים. אין ספק כי הבחירה של סוג תא עבור שיטה זו היא חשובה, במיוחד כאשר שואבי ECM לניתוח על ידי ספקטרומטריית מסה, אשר עשוי לדרוש כמות משמעותית של חלבון ECM הכולל.
מגבלות של הטכניקה
תאי מפרישי רמות נמוכות מאוד של חלבוני ECM יהיו מאתגרים יותר לשימוש בשיטה זו. תאים שאינם חסידים, תרביות תאי 3D, או מבחני פלישת תא אינם מתאימים כיום לבידוד ECM לפי שיטה זו. השיטה המתאימה ביותר לשימוש עם תקן "2-ממדי" בתרביות תאים. בגלל חילוץ אמוניום הידרוקסיד מסיר את התאים לחלוטין, ECM הקשורים הצדדים העליונים של תאים מופרשים, אבל הלא צולבים, חלבוני ECM יוסרו גם והותירו על צלחת שכבה דקה של ECM התאסף מלמטה מסביב לבסיסים של התאים 11,17 </sup>. זה מורכב לכמת כמה ECM הוא שוחרר על ידי מיצוי אמוניום הידרוקסיד, כי החומר שוחרר גם כולל חלבוני ECM כי הם תאי גם לפני הפרשה או לאחר ספיגה מתא השטח.
משמעות של הטכניקה ביחס קיימים / שיטות חלופיות
היכולת לבצע מגוון רחב של ניסויים עם ECM המבודד חשובה בהקשר של ביולוגיה של תא ופיזיולוגית רקמות, והוא גם בעל השלכות על תחומי התחדשות רקמות והנדסת רקמות. יש שיטת יתרונות על פני ג'ל נוצר collagens המטוהר או חלבוני ECM מטוהרים אחרים שתאים להרכיב מבני ECM מורכבים בגודל מולדתם, עם מנגנוני cross-linking יליד עם חלבוני ECM פרט נוכח היחסים מתאימים לסוג התא מוצא. לדוגמה, במחקר proteomic של RCS ECM הפגינו matrilins שופע COMP / TSP5, כצפויECM סחוסי 19,20 (איור 4). באופן כללי, הניתוח של ECM תא נגזרות נפגע מטבעה כמו רשת ענפה, רב-חלבון שגורמת crosslinking קוולנטיים ו insolubility של חלבוני ECM רבים, וגם על ידי האפשרות של זיהום ECM מחלץ עם חלבונים תאיים. הליך רב שלבים שנועד לבודד את החלק היחסי ECM מרקמות לניתוח proteomic ניב 8% של חלבוני ECM במערכה הכוללת של חלבונים מזוהים 21. עם זאת, פפטידים מחלבוני ECM היו 73% של פפטידים הכוללים מזוהים. שיטה זו לבידוד וניתוח של ECM תאים שמקורם במהירות ובאמינות מסיר חומר הסלולר תוך שמירת חלבוני ECM. שיטה זו יכולה לשמש עבור מגוון של סוגי תאים ויישומים במורד ומקל על הניתוח של ביולוגית ECM ואינטראקציות תא ECM תרבית תאים. הפרוטוקולים שלנו בפירוט כיצד ניתן ליישם השיטה בקני מידה שונה כדי לטפל במגוון רחב של expשאלות erimental בכל הנוגע לארגון ECM, דינמיקה, או רכב, ואת להשפעות התפקודיות של ECM מבודד על תאים.
יישומים עתידיים או כיווני לאחר מאסטרינג טכניקה זו
במבט לעתיד, השיטה יכולה להיות מותאמת לשימוש עם תרביות תאי 3D; זה ירחיב רלוונטי פיסיולוגי אינו רב. יש decellularized יליד רקמות פוטנציאל גדול כמו פיגום להתחדשות של רקמות אובדן או נזק ו כחלופה ההשתלה, כגון אי ספיקת לב לאחר 22. יש לו את הפוטנציאל להתגבר על הבעיות של זמינות תורם immunorejection. יישומים עתידיים של השיטה המתוארת בדוח זה יכול לחקור את השימוש שלה עם תרביות תאים 3D או decellularization רקמות, אשר נוסף יגדיל את היקף גישה זו.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים ביותר ד"ר בלינדה וילארד, פרוטאומיקה והמעבדה Metabolomics, מכון המחקר לרנר, קליבלנד קליניק, לביצוע ניתוח proteomics של ECM RCS. אנו מכירים את התמיכה הכספית של בריטניה המועצה למחקר theMedical, להעניק מספר K018043, כדי יק"א.
Materials
| Antibody to COL1A1 | Novus | NB600-408 | Rabbit polyclonal. Reacts with other fibrillar collagens as well as collagen I. IF: 1/200 |
| Antibody to fibronectin | Sigma | F3648 | Rabbit polyclonal. WB: 1/600 for 1.5 hr. IF: 1/200 |
| Antibody to thrombospondin 1 | ThermoFisher | MA5-13398 | Mouse monoclonal clone A6.1. WB: 1/150 for 1.5 hr |
| Antibody to RFP | Abcam | ab62341 | Rabbit polyclonal. WB: 1/2000 for 2 hr |
| Antibody to β-actin | Sigma | A1978 | Mouse monoclonal clone AC-15. WB: 1/10000 for 1.5 hr |
| Antibody to α-tubulin | Sigma | T9026 | Mouse monoclonal clone DM1A. WB: 1/5000 for 1.5 hr |
| Cell Tracker Green | ThermoFisher | C2925 | Fluorescent cell marker. Use at 1 µM for 30 min |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC)-Phalloidin | Sigma | P-5282 | Stock = 50mg/ml in DMSO.1/50 for 45 min |
| FITC-conjugated goat anti-mouse IgG | Sigma | F8771 | IF: 1/50 for 1 hr |
| FITC-conjugated sheep anti-rabbit IgG | SIgma | F7512 | IF: 1/50 for 1 hr |
| Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse IgG | LI-COR | 926-80010 | WB: 1/50000 for 1 hr |
| HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG | LI-COR | 926-80011 | WB: 1/100000 for 1 hr |
| Vectorshield mounting medium with DAPI | Vector | H-1200 | Store at 4 C in the dark |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma | D6429 | Warm before use |
| Fibroblast growth medium | PromoCell | C-23010 | Warm before use, supplement with 50 µg / mL ascorbic acid |
| Phenol red-free DMEM | ThermoFisher | 21063-029 | Warm before use |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | T3924 | Warm before use |
| Gridded glass-bottomed dish | MatTek | P35G-2-14-C-GRID | |
| NH4OH, 28% – 30% solution | Sigma | 221228 | Dilute to 20 mM in de-ionised water. Once opened store in the dark, tightly capped. |
| Paraformaldehyde, 16 % solution | Alfa Aesar | 43368 | Dilute to 2 % (v/v) in PBS |
| Deoxycholic acid | Sigma | D2510 | Use at 2 % (v/v) final concentration |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Dilute to 0.5 % (v/v) final concentration |
| GelCode Blue stain reagent | ThermoFisher | 24590 | Protein stain for SDS-PAGE gels |
| Precision Plus protein standards | Biorad | 161-0374 | Protein standards for SDS-PAGE gels |
| Trans-Blot SD Semi Dry transfer cell | Biorad | 1703940 | Efficient transfer of high molecular weight proteins |
| PVDF transfer membrane | Millipore | ISEQ00010 | Immobilon-PSQ |
| Ponceau S stain | Sigma | P7170 | Reversible protein stain for PVDF membrane |
| WesternSure Enhanced chemiluminescence (ECL) substrate | LI-COR | 926-80200 | |
| High performance chemiluminescence film | GE Healthcare | 28906837 | |
| Sterile filtration unit, MILLEX-GV | Millipore | ML481051 | |
| SP8 AOBS confocal laser scanning microscope | Leica | Environmental chamber needed for temperature and CO2 control (Life Imaging Services) | |
| Key: IF, Immunofluorescence; WB, Western Blot |
References
- Bonnans, C., Chou, J., Werb, Z. Remodelling the extracellular matrix in development and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 786-801 (2014).
- Hynes, R. O., Naba, A. Overview of the matrisome–an inventory of extracellular matrix constituents and functions. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, a004903 (2012).
- Gross, J., Highberger, J. H., Schmitt, F. O. Extraction of Collagen from Connective Tissue by Neutral Salt Solutions. Proc Natl Acad Sci U S A. 41, 1-7 (1955).
- Hellewell, A. L., Adams, J. C. Insider trading: Extracellular matrix proteins and their non-canonical intracellular roles. Bioessays. 38, 77-88 (2016).
- Li, D., Yang, W., Li, G. Y. Extraction of native collagen from limed bovine split wastes through improved pretreatment methods. Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 83, 1041-1048 (2008).
- Strawich, E., Nimni, M. E. Properties of a collagen molecule containing three identical components extracted from bovine articular cartilage. Biochemistry. 10, 3905-3911 (1971).
- Kim, B. S., et al. Human collagen isolated from adipose tissue. Biotechnol Prog. 28, 973-980 (2012).
- Barallobre-Barreiro, J., Didangelos, A., Yin, X., Domenech, N., Mayr, M. A sequential extraction methodology for cardiac extracellular matrix prior to proteomics analysis. Methods Mol Biol. 1005, 215-223 (2013).
- Carter, W. G. Transformation-dependent alterations is glycoproteins of extracellular matrix of human fibroblasts. Characterization of GP250 and the collagen-like GP140. J Biol Chem. 257, 13805-13815 (1982).
- Sechler, J. L., Takada, Y., Schwarzbauer, J. E. Altered rate of fibronectin matrix assembly by deletion of the first type III repeats. J Cell Biol. 134, 573-583 (1996).
- Adams, J. C., Bentley, A. A., Kvansakul, M., Hatherley, D., Hohenester, E. Extracellular matrix retention of thrombospondin 1 is controlled by its conserved C-terminal region. J Cell Sci. 121, 784-795 (2008).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Hillenkamp, F., Karas, M. Mass spectrometry of peptides and proteins by matrix-assisted ultraviolet laser desorption/ionization. Methods Enzymol. 193, 280-295 (1990).
- Davis, M. T., et al. Automated LC-LC-MS-MS platform using binary ion-exchange and gradient reversed-phase chromatography for improved proteomic analyses. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 752, 281-291 (2001).
- Burnette, W. N. "Western blotting": electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Anal Biochem. 112, 195-203 (1981).
- Soucy, P. A., Werbin, J., Heinz, W., Hoh, J. H., Romer, L. H. Microelastic properties of lung cell-derived extracellular matrix. Acta Biomater. 7, 96-105 (2011).
- Hellewell, A. L., Gong, X., Scharich, K., Christofidou, E. D., Adams, J. C. Modulation of the extracellular matrix patterning of thrombospondins by actin dynamics and thrombospondin oligomer state. Biosci Rep. 35, (2015).
- Mumby, S. M., Abbott-Brown, D., Raugi, G. J., Bornstein, P. Regulation of thrombospondin secretion by cells in culture. J Cell Physiol. 120, 280-288 (1984).
- Myllyharju, J. Extracellular matrix and developing growth plate. Curr Osteoporos Rep. 12, 439-445 (2014).
- Roughley, P. J. Articular cartilage and changes in arthritis: noncollagenous proteins and proteoglycans in the extracellular matrix of cartilage. Arthritis Res. 3, 342-347 (2001).
- Naba, A., et al. The matrisome: in silico definition and in vivo characterization by proteomics of normal and tumor extracellular matrices. Mol Cell Proteomics. 11, M111 014647 (2012).
- Sanchez, P. L., et al. Acellular human heart matrix: A critical step toward whole heart grafts. Biomaterials. 61, 279-289 (2015).
