Recogida de suero y libre de alimentador madre embrionarias de ratón medio celular acondicionado para un enfoque libre de células
Summary
Este protocolo proporciona un método para la obtención de células madre embrionarias de ratón (MESC) -conditioned medio (mESC-CM) derivado de suero (suero bovino fetal, FBS) – y alimentadoras (fibroblastos de embriones de ratón, MEFs) -free condiciones para una célula enfoque exento. Puede ser aplicable para el tratamiento de envejecimiento y las enfermedades de envejecimiento asociado.
Abstract
The capacity of embryonic stem cells (ESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs) to generate various cell types has opened new avenues in the field of regenerative medicine. However, despite their benefits, the tumorigenic potential of ESCs and iPSCs has long been a barrier for clinical applications. Interestingly, it has been shown that ESCs produce several soluble factors that can promote tissue regeneration and delay cellular aging, suggesting that ESCs and iPSCs can also be utilized as a cell-free intervention method. Therefore, the method for harvesting mouse embryonic stem cell (mESC)-conditioned medium (mESC-CM) with minimal contamination of serum components (fetal bovine serum, FBS) and feeder cells (mouse embryonic fibroblasts, MEFs) has been highly demanded. Here, the present study demonstrates an optimized method for the collection of mESC-CM under serum- and feeder-free conditions and for the characterization of mESC-CM using senescence-associated multiple readouts. This protocol will provide a method to collect pure mESC-specific secretory factors without serum and feeder contamination.
Introduction
El objetivo de este protocolo es recoger células madre embrionarias de ratón (MESC) -conditioned medio (mESC-CM) a partir de las condiciones de cultivo sin suero y libre de alimentadoras y caracterizar sus funciones biológicas.
En general, las células madre embrionarias (CES) tienen un gran potencial para la medicina regenerativa y la terapia celular debido a su pluripotencia y capacidad de auto-renovación 1-3. Sin embargo, el trasplante directo de las células madre tiene varias limitaciones, tales como el rechazo inmune y la formación de tumor 4,5. Por lo tanto, un enfoque libre de células puede proporcionar una estrategia terapéutica alternativa para la medicina regenerativa y las intervenciones de envejecimiento 6,7.
La senescencia es vista como un homólogo celular para el envejecimiento de los tejidos y órganos, que se caracteriza por un estado permanente de detención del crecimiento, alteración de la fisiología celular, y comportamientos. El envejecimiento es el principal factor de riesgo para las enfermedades prevalentes, incluyendo cáncer, enfermedades cardiovasculares, type la diabetes 2, 8 y la neurodegeneración. Una de las características evidentes del envejecimiento es la disminución en el potencial de regeneración de los tejidos, que es causada por el envejecimiento de células madre y el agotamiento 9. Muchos estudios han demostrado importantes moléculas farmacológicas, tales como la rapamicina 9, resveratrol 10, y metformina 11, y factores sistémicos transmitidas por la sangre, a saber, GDF11 12, que tiene la capacidad de retrasar el envejecimiento consistentemente y extender la vida.
En el presente estudio, mESC-CM ha sido cosechada sin suero capas (suero fetal bovino, FBS) y el alimentador (fibroblastos embrionarios de ratón, los MEF) para excluir la contaminación de los factores del suero y factores de secreción de MEFs. Estas condiciones permitieron un CM de suero y libre de alimentador que, por consiguiente permitió la identificación precisa de los factores de secreción mESC-específicas.
Este protocolo propuesto es altamente eficiente y relativamente rentable y fácilpara operar. Esta técnica proporciona información detallada sobre la caracterización de los factores solubles derivados de mESC que puede mediar un efecto anti-senescencia, que puede utilizarse para el desarrollo de un enfoque terapéutico libre de células seguro y potencialmente ventajoso hacia intervenciones para las enfermedades de envejecimiento asociado y otros regenerativa tratos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para el éxito de la recogida del suero y mESC-CM sin alimentador, las siguientes sugerencias deben ser tomados en consideración. El factor más importante es el uso de mESCs principios de paso para la recogida de mESC-CM. Anteriormente, se ha demostrado que temprano paso mESC-CM tiene mejores efectos anti-envejecimiento en comparación con mESCs paso finales. El número de pases de mESCs se ha informado que afectan a su potencial de desarrollo 16 y pluripotencia 17.
A…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue apoyada por el Programa de Investigación de Ciencias Básicas (2013R1A1A2060930) y el Programa del Centro de Investigación Médica (2015R1A5A2009124) a través de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF), financiado por el Ministerio de Ciencia, TIC, y la planificación futura. Esta investigación también está apoyado por una subvención de funcionamiento Puesta en marcha del Hospital for Sick Children (HK Sung). Nos gustaría dar las gracias a Laura y Sara Barwell JS Kim por su excelente ayuda en la edición de este manuscrito y el doctor Andras Nagy para proporcionar la línea G4 mESC.
Materials
| DMEM | Invitrogen | #11960-044 | |
| FBS | Invitrogen | #30044333 | 20%, ES cell quality |
| Penicillin and streptomycin | Invitrogen | #15140 | 50units/ml penicillin and 50mg/ml strepto |
| -mycin. | |||
| L-glutamine | Invitrogen | #25030 | 2mM |
| Nonessential amino acids (NEAA) | Invitrogen | #11140 | 100uM |
| β-mercaptoethanol | Sigma | #M3148 | 100uM |
| Leukemia inhibitory factor | Millipore | #ESG1107 | 100units/ml |
| OPTI-MEM | Invitrogen | #22600 | |
| X-gal | Sigma | #B4252 | 1mg/ml |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | 3.70% |
| Dimethylformamide (DMF) | Sigma | #D4551 | |
| Potassium ferricyanide | Aldrich | #455946 | 5mM |
| potassium ferrocyanide | Aldrich | #455989 | 5mM |
| NaCl | Sigma | #S7653 | 150mM |
| MgCl2 | Sigma | #M2393 | 2mM |
| Mytomycin C | Sigma | #M4287 | 10ug/ml |
| Propidium iodide | Sigma | #P4170 | 50ug/ml |
| TRIzol | Ambion | #15596018 | |
| M-MLV reverse transcript-tase | Promega | #M170B | |
| Power SYBR Green PCR master mix | Applied Biosystems | #4367659 | |
| HDFs, NHDF-Ad-Der-Fibroblast | LONZA | #CC-2511 | |
| Bottle top filter, | Corning | #430513 | 0.2μm |
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