פרוטוקול זה מספק שיטה לאיסוף תאי גזע עוברי בעכבר (המסקלין) בינוני -conditioned (המסקלין-CM) נגזר סרום (נסיוב שור עוברי, FBS) – ומזין (פיברובלסטים עובריים בעכבר, MEFs) תנאים -חינם עבור תא גישת -חינם. זה עשוי להיות רלוונטי לטיפול הזדקנות ומחלות הקשורות להזדקנות.
The capacity of embryonic stem cells (ESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs) to generate various cell types has opened new avenues in the field of regenerative medicine. However, despite their benefits, the tumorigenic potential of ESCs and iPSCs has long been a barrier for clinical applications. Interestingly, it has been shown that ESCs produce several soluble factors that can promote tissue regeneration and delay cellular aging, suggesting that ESCs and iPSCs can also be utilized as a cell-free intervention method. Therefore, the method for harvesting mouse embryonic stem cell (mESC)-conditioned medium (mESC-CM) with minimal contamination of serum components (fetal bovine serum, FBS) and feeder cells (mouse embryonic fibroblasts, MEFs) has been highly demanded. Here, the present study demonstrates an optimized method for the collection of mESC-CM under serum- and feeder-free conditions and for the characterization of mESC-CM using senescence-associated multiple readouts. This protocol will provide a method to collect pure mESC-specific secretory factors without serum and feeder contamination.
מטרת פרוטוקול זה היא לאסוף עכבר בתאי גזע עובריים (המסקלין) בינוני -conditioned (המסקלין-CM) מן התנאים תרבות serum- ומזין ללא ולאפיין תפקודים ביולוגיים שלה.
באופן כללי, תאי גזע עובריים (ESCs) יש פוטנציאל גדול עבור רפואה רגנרטיבית וטיפול התא עקב מגוונת" ויכולתן עבור התחדשות עצמית 1-3. עם זאת, ההשתלה הישירה של תאי גזע יש מספר מגבלות, כגון דחייה חיסונית גידול היווצרות 4,5. לכן, גישת תא ללא עשויה לספק אסטרטגיה טיפולית חלופית עבור רפואת רגנרטיבית והתערבויות הזדקנות 6,7.
ההזדקנות נתפסת עמיתו הסלולר הזדקנות רקמות ואיברים, המאופיינת במצב מתמיד של מעצר צמיחה, פיזיולוגית תא שהשתנתה ולאחר התנהגויות. הזדקנות היא גרם הסיכון העיקרי למחלות נפוצות כולל הסרטן, מחלות לב וכלי דם, type 2 סוכרת, ניוון מוחיים 8. אחד המאפיינים הברורים של הזדקנות היא ירידת פוטנציאל ההתחדשות של רקמות, אשר נגרם על ידי הזדקנות תאי גזע ותשישות 9. מחקרים רבים הראו משמעותי מולקולות תרופתיות, כגון rapamycin 9, רזברטרול 10, ומטפורמין 11, וגורמים מערכתיים שמקורן בדם, כלומר GDF11 12, שיש להם את היכולת לעכב הזדקנות בעקביות להאריך את תוחלת חיים.
במחקר הנוכחי, המסקלין-CM נקצר ללא בסרום (בסרום שור עוברי, FBS) ומזין (פיברובלסטים עובריים בעכבר, MEFs) שכבות כדי לשלול את הזיהום של גורמים בסרום וגורם הפרשה מן MEFs. תנאים אלה אפשרו CM serum- והמזין ללא ושכתוצאה מכך אפשר זיהוי המדויק של גורמי פרשת המסקלין ספציפיים.
פרוטוקול מוצע זה יעיל ביותר, יחסית חסכוני, וקללהפעיל. טכניקה זו מספקת תובנה על האפיון של גורמים מסיסים הנגזרות המסקלין שיכול לתווך אפקט אנטי-הזדקנות, אשר עשוי לשמש לפיתוח גישה טיפולית בטוחה יתרון פוטנציאלי ללא תא כלפי התערבויות למחל הזדקנות קשורה ומבריא אחר טיפולים.
עבור האוסף המוצלח של serum- ומזין ללא המסקלין-CM, את ההצעות הבאות צריכות להילקח בחשבון. הגורם הקריטי ביותר הוא באמצעות mESCs הפרקים המוקדמים לאיסוף המסקלין-CM. בעבר, הוכח כי מוקדם מעבר המסקלין-CM יש השפעות אנטי אייג'ינג טוב יותר לעומת mESCs מעבר מאוחר. מספר חלוף mESCs דווח להשפיע …
The authors have nothing to disclose.
מחקר זה מומן על ידי תכנית המחקר במדעי יסוד (2013R1A1A2060930) ותכנית המרכז למחקר הרפואית (2015R1A5A2009124) באמצעות קרן המחקר הלאומית של קוריאה (NRF), הממומן על ידי משרד המדע, ICT, ותכנון לעתיד. מחקר זה נתמך גם על ידי חברת סטארט-אפ הפעלה מענק מטעם בית החולים לילדים (HK סונג). ברצוננו להודות לורה Barwell ושרה JS קים לעזרה שלהם מעולה בעריכת כתב היד הזה וד"ר אנדרס Nagy למתן הקו G4 המסקלין.
DMEM | Invitrogen | #11960-044 | |
FBS | Invitrogen | #30044333 | 20%, ES cell quality |
Penicillin and streptomycin | Invitrogen | #15140 | 50units/ml penicillin and 50mg/ml strepto |
-mycin. | |||
L-glutamine | Invitrogen | #25030 | 2mM |
Nonessential amino acids (NEAA) | Invitrogen | #11140 | 100uM |
β-mercaptoethanol | Sigma | #M3148 | 100uM |
Leukemia inhibitory factor | Millipore | #ESG1107 | 100units/ml |
OPTI-MEM | Invitrogen | #22600 | |
X-gal | Sigma | #B4252 | 1mg/ml |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | 3.70% |
Dimethylformamide (DMF) | Sigma | #D4551 | |
Potassium ferricyanide | Aldrich | #455946 | 5mM |
potassium ferrocyanide | Aldrich | #455989 | 5mM |
NaCl | Sigma | #S7653 | 150mM |
MgCl2 | Sigma | #M2393 | 2mM |
Mytomycin C | Sigma | #M4287 | 10ug/ml |
Propidium iodide | Sigma | #P4170 | 50ug/ml |
TRIzol | Ambion | #15596018 | |
M-MLV reverse transcript-tase | Promega | #M170B | |
Power SYBR Green PCR master mix | Applied Biosystems | #4367659 | |
HDFs, NHDF-Ad-Der-Fibroblast | LONZA | #CC-2511 | |
Bottle top filter, | Corning | #430513 | 0.2μm |