Raccolta di di siero e senza alimentatore staminali embrionali di topo medio-Cell condizionata per un approccio libero-Cell
Summary
Questo protocollo fornisce un metodo per la raccolta di cellule staminali embrionali di topo (Mesc) medio -conditioned (Mesc-CM) derivato dal siero (siero fetale bovino, FBS) – e di alimentazione (fibroblasti embrionali di topo, MEF) Condizioni senza glutine per una cella approccio-free. Può essere applicabile per il trattamento di invecchiamento e malattie associate invecchiamento.
Abstract
The capacity of embryonic stem cells (ESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs) to generate various cell types has opened new avenues in the field of regenerative medicine. However, despite their benefits, the tumorigenic potential of ESCs and iPSCs has long been a barrier for clinical applications. Interestingly, it has been shown that ESCs produce several soluble factors that can promote tissue regeneration and delay cellular aging, suggesting that ESCs and iPSCs can also be utilized as a cell-free intervention method. Therefore, the method for harvesting mouse embryonic stem cell (mESC)-conditioned medium (mESC-CM) with minimal contamination of serum components (fetal bovine serum, FBS) and feeder cells (mouse embryonic fibroblasts, MEFs) has been highly demanded. Here, the present study demonstrates an optimized method for the collection of mESC-CM under serum- and feeder-free conditions and for the characterization of mESC-CM using senescence-associated multiple readouts. This protocol will provide a method to collect pure mESC-specific secretory factors without serum and feeder contamination.
Introduction
L'obiettivo di questo protocollo è quello di raccogliere il mouse sulle cellule staminali embrionali (Mesc) medio -conditioned (Mesc-CM) da condizioni di coltura di siero e privo di alimentazione e per caratterizzare le sue funzioni biologiche.
In generale, le cellule staminali embrionali (ESC) hanno un grande potenziale per la medicina rigenerativa e terapia cellulare per la loro pluripotenza e la capacità di auto-rinnovamento 1-3. Tuttavia, il trapianto diretto di cellule staminali ha diverse limitazioni, come rigetto immunitario e la formazione del tumore 4,5. Pertanto, un approccio libero-cella può fornire una strategia terapeutica alternativa per la medicina rigenerativa e invecchiamento interventi 6,7.
Senescenza è visto come controparte cellulare per l'invecchiamento dei tessuti e organi, caratterizzato da uno stato permanente di arresto della crescita, fisiologia cellulare alterata e comportamenti. L'invecchiamento è il principale fattore di rischio per le malattie prevalenti tra cui il cancro, le malattie cardiovascolari, tipo diabete 2, e neurodegenerazione 8. Una delle caratteristiche evidenti di invecchiamento è la diminuzione del potenziale rigenerativo dei tessuti, che è causato da invecchiamento delle cellule staminali e la stanchezza 9. Molti studi hanno dimostrato significativi molecole farmacologiche, come la rapamicina 9, il resveratrolo 10, e metformina 11, e fattori sistemici per via ematica, cioè GDF11 12, che hanno la capacità di ritardare l'invecchiamento in modo coerente ed estendere durata della vita.
Nel presente studio, Mesc-CM è stato raccolto senza siero strati (siero fetale bovino, FBS) e l'alimentatore (fibroblasti embrionali di topo, MEF) per escludere la contaminazione di fattori di siero e fattori di secrezione dal MEF. Queste condizioni consentite per un CM di siero e privo di alimentatore che di conseguenza ha permesso l'identificazione accurata di Mesc-specifici fattori secretoria.
Questo protocollo proposto è altamente efficiente, relativamente conveniente e facileoperare. Questa tecnica fornisce intuizioni la caratterizzazione di fattori solubili Mesc-derivati che possono mediare un effetto anti-senescenza, che può essere usato per lo sviluppo di un approccio terapeutico privo di cellule sicuro e potenzialmente vantaggiosa verso interventi per le malattie invecchiamento associate e altre rigenerativa trattamenti.
Protocol
Representative Results
Discussion
Per la collezione di successo di di siero e Mesc-CM senza alimentatore, i seguenti suggerimenti dovrebbero essere presi in considerazione. Il fattore più critico è usando mESCs passaggio primi per la raccolta di Mesc-CM. In precedenza, è stato dimostrato che il passaggio anticipato Mesc-CM ha migliori effetti anti-invecchiamento rispetto al mESCs fine del passaggio. Stato segnalato il numero passaggio di mESCs di influenzare il loro potenziale di sviluppo 16 e 17 pluripotenza.
<p class="jove…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata sostenuta dalla scienza Basic Program Research (2013R1A1A2060930) e il Medical Research Programma Center (2015R1A5A2009124) attraverso la Fondazione Nazionale delle Ricerche di Corea (NRF), finanziato dal Ministero della Scienza, ICT, e la pianificazione futura. Questa ricerca è supportata anche da una start-up sovvenzione di funzionamento dalla Hospital for Sick Children (HK Sung). Vorremmo ringraziare Laura e Sarah Barwell JS Kim per la loro eccellente aiuto nella redazione di questo manoscritto e il Dr. Andras Nagy per la fornitura della linea G4 Mesc.
Materials
| DMEM | Invitrogen | #11960-044 | |
| FBS | Invitrogen | #30044333 | 20%, ES cell quality |
| Penicillin and streptomycin | Invitrogen | #15140 | 50units/ml penicillin and 50mg/ml strepto |
| -mycin. | |||
| L-glutamine | Invitrogen | #25030 | 2mM |
| Nonessential amino acids (NEAA) | Invitrogen | #11140 | 100uM |
| β-mercaptoethanol | Sigma | #M3148 | 100uM |
| Leukemia inhibitory factor | Millipore | #ESG1107 | 100units/ml |
| OPTI-MEM | Invitrogen | #22600 | |
| X-gal | Sigma | #B4252 | 1mg/ml |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | 3.70% |
| Dimethylformamide (DMF) | Sigma | #D4551 | |
| Potassium ferricyanide | Aldrich | #455946 | 5mM |
| potassium ferrocyanide | Aldrich | #455989 | 5mM |
| NaCl | Sigma | #S7653 | 150mM |
| MgCl2 | Sigma | #M2393 | 2mM |
| Mytomycin C | Sigma | #M4287 | 10ug/ml |
| Propidium iodide | Sigma | #P4170 | 50ug/ml |
| TRIzol | Ambion | #15596018 | |
| M-MLV reverse transcript-tase | Promega | #M170B | |
| Power SYBR Green PCR master mix | Applied Biosystems | #4367659 | |
| HDFs, NHDF-Ad-Der-Fibroblast | LONZA | #CC-2511 | |
| Bottle top filter, | Corning | #430513 | 0.2μm |
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