血清やフィーダーフリーのマウス胚のコレクションは、無細胞アプローチのための細胞馴化培地を幹
Summary
このプロトコルは、マウス胚性幹細胞（MESC）を収集するための方法を提供するメディア-conditioned（MESC-CM）血清（ウシ胎児血清、FBS）に由来する – とフィーダー細胞のための（マウス胚線維芽細胞、MEFの）フリー条件フリーアプローチ。これは、老化や老化関連疾患の治療のために適用することができます。
Abstract
The capacity of embryonic stem cells (ESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs) to generate various cell types has opened new avenues in the field of regenerative medicine. However, despite their benefits, the tumorigenic potential of ESCs and iPSCs has long been a barrier for clinical applications. Interestingly, it has been shown that ESCs produce several soluble factors that can promote tissue regeneration and delay cellular aging, suggesting that ESCs and iPSCs can also be utilized as a cell-free intervention method. Therefore, the method for harvesting mouse embryonic stem cell (mESC)-conditioned medium (mESC-CM) with minimal contamination of serum components (fetal bovine serum, FBS) and feeder cells (mouse embryonic fibroblasts, MEFs) has been highly demanded. Here, the present study demonstrates an optimized method for the collection of mESC-CM under serum- and feeder-free conditions and for the characterization of mESC-CM using senescence-associated multiple readouts. This protocol will provide a method to collect pure mESC-specific secretory factors without serum and feeder contamination.
Introduction
このプロトコルの目的は、血清および無フィーダー培養条件から培地（MESC-CM）を-conditionedし、その生物学的機能を特徴づけるために、マウス胚性幹細胞（MESC）を収集することです。
一般的には、胚性幹細胞（ESCは）による自己再生1-3のための彼らの多能性と能力に再生医療や細胞治療のための大きな可能性を持っています。しかし、幹細胞の直接移植は、免疫拒絶および腫瘍形成4,5のようないくつかの制限を有します。従って、無細胞アプローチは、再生医療や老化介入6,7の代替治療戦略を提供することができます。
老化は、増殖停止、改変された細胞生理学、および行動の永続的な状態によって特徴付けられる組織や臓器の老化に対する細胞相手と見られています。老化、癌、心臓血管疾患、Tなどの流行病のための主要な危険因子であります2型糖尿病、および神経変性8を YPE。老化の明らかな特徴の一つは、幹細胞の老化や枯渇9によって引き起こされる組織の再生能力の低下、です。多くの重要な研究は、このような一貫して老化を遅らせ、寿命を延長する能力を持っているラパマイシン9、レスベラトロール10、およびメトホルミン11、および血液媒介全身の要因、すなわちGDF11 12、薬理学的分子を、示しています。
本研究では、MESC-CMは、血清因子とのMEFからの分泌因子の混入を排除するために、血清（ウシ胎児血清、FBS）およびフィーダー（マウス胚線維芽細胞、MEFの）層なしで収穫されています。これらの条件は、結果的にMESC固有の分泌因子の正確な同定を可能に血清および無フィーダーCMを可能にしました。
この提案されたプロトコルは、非常に効率的で比較的費用対効果、および容易動作します。この技術は、老化関連疾患及びその他の再生のための介入に向かって安全かつ潜在的に有利な無細胞治療アプローチの開発のために使用することができる抗老化効果を媒介することができるMESC由来の可溶性因子の特性への洞察を提供しますトリートメント。
Protocol
Representative Results
Discussion
血清および無フィーダーMESC-CMの成功収集のために、以下の提案を考慮に入れなければなりません。最も重要な要因は、MESC-CMを収集するための初期継代たmESCを使用しています。以前は、初期継代MESC-CMは、後期継代たmESCと比較して、より良好なアンチエイジング効果を有することが示されています。たmESCの継代数は、それらの発生能16及び多能17に影響を与えることが…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、基礎科学研究開発プログラム（2013R1A1A2060930）および医学研究センタープログラム（2015R1A5A2009124）韓国国立研究財団を通じて（NRF）、科学、ICT省が資金を提供し、今後の計画によってサポートされていました。この研究はまた、病気の子供のための病院からの起動オペレーティング・グラント（HK歌唱）でサポートされています。私たちは、G4 MESCラインを提供するために、この原稿博士アンドラーシュナジの編集中にその優れた助けのためのLaura BarwellとサラJSキムに感謝したいと思います。
Materials
| DMEM | Invitrogen | #11960-044 | |
| FBS | Invitrogen | #30044333 | 20%, ES cell quality |
| Penicillin and streptomycin | Invitrogen | #15140 | 50units/ml penicillin and 50mg/ml strepto |
| -mycin. | |||
| L-glutamine | Invitrogen | #25030 | 2mM |
| Nonessential amino acids (NEAA) | Invitrogen | #11140 | 100uM |
| β-mercaptoethanol | Sigma | #M3148 | 100uM |
| Leukemia inhibitory factor | Millipore | #ESG1107 | 100units/ml |
| OPTI-MEM | Invitrogen | #22600 | |
| X-gal | Sigma | #B4252 | 1mg/ml |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | 3.70% |
| Dimethylformamide (DMF) | Sigma | #D4551 | |
| Potassium ferricyanide | Aldrich | #455946 | 5mM |
| potassium ferrocyanide | Aldrich | #455989 | 5mM |
| NaCl | Sigma | #S7653 | 150mM |
| MgCl2 | Sigma | #M2393 | 2mM |
| Mytomycin C | Sigma | #M4287 | 10ug/ml |
| Propidium iodide | Sigma | #P4170 | 50ug/ml |
| TRIzol | Ambion | #15596018 | |
| M-MLV reverse transcript-tase | Promega | #M170B | |
| Power SYBR Green PCR master mix | Applied Biosystems | #4367659 | |
| HDFs, NHDF-Ad-Der-Fibroblast | LONZA | #CC-2511 | |
| Bottle top filter, | Corning | #430513 | 0.2μm |
References
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Lavasani, M., et al. Muscle-derived stem/progenitor cell dysfunction limits healthspan and lifespan in a murine progeria model. Nat Commun. 3, 608 (2012).
- Woo, D. H., et al. Direct and indirect contribution of human embryonic stem cell-derived hepatocyte-like cells to liver repair in mice. Gastroenterology. 142, 602-611 (2012).
- Lee, A. S., Tang, C., Rao, M. S., Weissman, I. L., Wu, J. C. Tumorigenicity as a clinical hurdle for pluripotent stem cell therapies. Nat Med. 19, 998-1004 (2013).
- Moon, S. H., et al. A system for treating ischemic disease using human embryonic stem cell-derived endothelial cells without direct incorporation. Biomaterials. 32, 6445-6455 (2011).
- Tongers, J., Roncalli, J. G., Losordo, D. W. Therapeutic angiogenesis for critical limb ischemia: microvascular therapies coming of age. Circulation. 118, 9-16 (2008).
- Lazarous, D. F., et al. Basic fibroblast growth factor in patients with intermittent claudication: results of a phase I trial. J Am Coll Cardiol. 36, 1239-1244 (2000).
- Adams, P. D. Healing and hurting: molecular mechanisms, functions, and pathologies of cellular senescence. Mol Cell. 36, 2-14 (2009).
- Harrison, D. E., et al. Rapamycin fed late in life extends lifespan in genetically heterogeneous mice. Nature. 460, 392-395 (2009).
- Baur, J. A., Ungvari, Z., Minor, R. K., Le Couteur, D. G., de Cabo, R. Are sirtuins viable targets for improving healthspan and lifespan. Nat Rev Drug Discov. 11, 443-461 (2012).
- Martin-Montalvo, A., et al. Metformin improves healthspan and lifespan in mice. Nat Commun. 4, 2192 (2013).
- Loffredo, F. S., et al. Growth differentiation factor 11 is a circulating factor that reverses age-related cardiac hypertrophy. Cell. 153, 828-839 (2013).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. , (2012).
- Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nat Protoc. 4, 1798-1806 (2009).
- Bae, Y. U., Choi, J. H., Nagy, A., Sung, H. K., Kim, J. R. Antisenescence effect of mouse embryonic stem cell conditioned medium through a PDGF/FGF pathway. FASEB J. 30, 1276-1286 (2016).
- Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90, 8424-8428 (1993).
- Li, X. Y., et al. Passage number affects the pluripotency of mouse embryonic stem cells as judged by tetraploid embryo aggregation. Cell Tissue Res. 327, 607-614 (2007).
- Mbeunkui, F., Fodstad, O., Pannell, L. K. Secretory protein enrichment and analysis: an optimized approach applied on cancer cell lines using 2D LC-MS/MS. J Proteome Res. 5, 899-906 (2006).
- Makridakis, M., Vlahou, A. Secretome proteomics for discovery of cancer biomarkers. J Proteomics. 73, 2291-2305 (2010).
- Kim, K. S., et al. Regulation of replicative senescence by insulin-like growth factor-binding protein 3 in human umbilical vein endothelial cells. Aging Cell. 6, 535-545 (2007).
- Kim, K. S., et al. Induction of cellular senescence by insulin-like growth factor binding protein-5 through a p53-dependent mechanism. Mol Biol Cell. 18, 4543-4552 (2007).
- Eiselleova, L., et al. Comparative study of mouse and human feeder cells for human embryonic stem cells. Int J Dev Biol. 52, 353-363 (2008).
