무 혈청의 수집 및 공급 장치없이 마우스 배아는 세포 자유로운 접근을위한 세포 조절 중간 줄기
Summary
이 프로토콜은 혈청에서 파생 마우스 배아 줄기 세포의 수집 (MESC) -conditioned 매체 (MESC-CM)하는 방법을 제공한다 (소 태아 혈청, FBS) – 및 공급 장치 (마우스 배아 섬유 아세포, MEFs에) 셀에 대한 – 무료 조건 – 무료 방법. 이는 노화 및 노화 관련 질환의 치료에 적용될 수있다.
Abstract
The capacity of embryonic stem cells (ESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs) to generate various cell types has opened new avenues in the field of regenerative medicine. However, despite their benefits, the tumorigenic potential of ESCs and iPSCs has long been a barrier for clinical applications. Interestingly, it has been shown that ESCs produce several soluble factors that can promote tissue regeneration and delay cellular aging, suggesting that ESCs and iPSCs can also be utilized as a cell-free intervention method. Therefore, the method for harvesting mouse embryonic stem cell (mESC)-conditioned medium (mESC-CM) with minimal contamination of serum components (fetal bovine serum, FBS) and feeder cells (mouse embryonic fibroblasts, MEFs) has been highly demanded. Here, the present study demonstrates an optimized method for the collection of mESC-CM under serum- and feeder-free conditions and for the characterization of mESC-CM using senescence-associated multiple readouts. This protocol will provide a method to collect pure mESC-specific secretory factors without serum and feeder contamination.
Introduction
이 프로토콜의 목표는 무 혈청 및 공급 장치가없는 배양 조건에서 마우스를 배아 줄기 세포 (MESC) -conditioned 매체 (MESC-CM)를 수집하고 그 생물학적 기능을 특성화하는 것입니다.
일반적으로 배아 줄기 세포 (는 ESC가)에 의한 자기 갱신 1-3에 대한 자신의 다 능성 및 용량에 재생 의학 및 세포 치료에 대한 큰 잠재력을 가지고있다. 그러나 줄기 세포의 직접적인 이식에는 면역 거부 및 종양 형성 4,5- 등 여러 한계를 가지고있다. 따라서, 무 세포 방법은 재생 의료 노화 개입 -6,7- 대한 다른 치료 전략을 제공 할 수있다.
노화는 성장 체포, 변형 된 세포 생리학과 행동의 영구적 인 상태에 의해 특징 조직과 장기의 노화에 휴대 대응으로 볼 수 있습니다. 암을 포함한 널리 질환, 심혈관 질환, t의 주요 위험 인자는 노화2 형 당뇨병을 YPE 및 신경 퇴행 8. 노화의 명백한 특성 중 하나는 줄기 세포 노화 및 배기 (9)에 의해 발생 조직의 재생 가능성의 감소이다. 많은 중요한 연구들은 일관 노화를 지연시키고 수명을 연장 할 수있는 능력을 가지고 라파 9 레스베라트롤 10 및 메트포르민 (11)과 혈액 유래 조직 인자, 즉 12 GDF11 같은 약물 분자를 보여 주었다.
본 연구에서는 MESC-CM은 혈청 요소 및 MEFs에에서 분비 인자의 오염을 제외 혈청없이 (소 태아 혈청, FBS) 및 공급 장치 (마우스 배아 섬유 아세포, MEFs에) 레이어를 수확하고있다. 결과적으로 MESC 별 분비 요인의 정확한 식별을 사용하도록 설정된 무 혈청 및 공급 장치가없는 CM 허용 이러한 조건.
이 제안 된 프로토콜은 상대적으로 매우 효율적인 비용 대비 효과, 쉽게한다작동합니다. 이 기술은 노화 관련 질환 등의 재생에 대한 개입을 향해 안전하고 잠재적으로 유리한 무 세포 치료 방법의 개발에 사용될 수있는 항 노화 효과를 매개 할 수 MESC 유래 가용성 요소의 특성화에 대한 통찰력을 제공한다 트리트먼트.
Protocol
Representative Results
Discussion
무 혈청 피더없는 MESC-CM의 성공적인 회수를 들어, 다음 방법이 고려되어야한다. 가장 중요한 요인은 MESC-CM의 컬렉션에 대한 초기 통로 mESCs를 사용합니다. 이전에는 초기 통로 MESC-CM 늦게 통과 mESCs에 비해 더 나은 안티 에이징 효과를 가지고 있음을 보였다. mESCs의 통과 수는 그들의 발달 잠재력 (16) 및 다 능성 (17)에 영향을 미치는 것으로보고되었다.
추가적인…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 기초 과학 연구 프로그램 (2013R1A1A2060930) 및 의료 연구 센터 프로그램 (2015R1A5A2009124) 한국 연구 재단을 통해 (NRF), 과학, ICT의 교육부에 의해 투자 및 미래 계획에 의해 지원되었다. 이 연구는 또한 병원 아픈 어린이를위한 (HK) 성에서 시작해서 운영 그랜트에 의해 지원됩니다. 우리는 G4 MESC 라인을 제공하기 위해이 원고 박사 안드라스 나기 편집에서 우수한 도움 로라 Barwell 사라 JS 김에게 감사의 말씀을 전합니다.
Materials
| DMEM | Invitrogen | #11960-044 | |
| FBS | Invitrogen | #30044333 | 20%, ES cell quality |
| Penicillin and streptomycin | Invitrogen | #15140 | 50units/ml penicillin and 50mg/ml strepto |
| -mycin. | |||
| L-glutamine | Invitrogen | #25030 | 2mM |
| Nonessential amino acids (NEAA) | Invitrogen | #11140 | 100uM |
| β-mercaptoethanol | Sigma | #M3148 | 100uM |
| Leukemia inhibitory factor | Millipore | #ESG1107 | 100units/ml |
| OPTI-MEM | Invitrogen | #22600 | |
| X-gal | Sigma | #B4252 | 1mg/ml |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | 3.70% |
| Dimethylformamide (DMF) | Sigma | #D4551 | |
| Potassium ferricyanide | Aldrich | #455946 | 5mM |
| potassium ferrocyanide | Aldrich | #455989 | 5mM |
| NaCl | Sigma | #S7653 | 150mM |
| MgCl2 | Sigma | #M2393 | 2mM |
| Mytomycin C | Sigma | #M4287 | 10ug/ml |
| Propidium iodide | Sigma | #P4170 | 50ug/ml |
| TRIzol | Ambion | #15596018 | |
| M-MLV reverse transcript-tase | Promega | #M170B | |
| Power SYBR Green PCR master mix | Applied Biosystems | #4367659 | |
| HDFs, NHDF-Ad-Der-Fibroblast | LONZA | #CC-2511 | |
| Bottle top filter, | Corning | #430513 | 0.2μm |
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