El tratamiento de drogas y<em> En Vivo</em> Imagen de osteoblasto-osteoclastos Interacciones en un modelo Medaka pescado osteoporosis

El esqueleto de los vertebrados proporciona soporte estructural y la protección de órganos, permite la movilidad, y sirve como una fuente de calcio. A lo largo de la vida, la matriz ósea extracelular se gira constantemente a mantener la estabilidad del hueso y la rigidez. Este proceso requiere la actividad estrechamente coordinada y la interacción de los osteoblastos que forman el hueso y los osteoclastos de resorción ósea. Los osteoblastos se derivan a partir de progenitores mesenquimales multipotentes y producen colágeno para formar el osteoide, la parte proteica de la matriz ósea ^10. Los osteoblastos interactúan con los osteoclastos para lograr una actividad equilibrada de ambos tipos de células, que se requiere para el control de la homeostasis ósea ^7. Debido a estas interacciones reguladoras intrincados, las respuestas al tratamiento de drogas y la homeostasis ósea no pueden ser examinadas utilizando plenamente los estudios in vitro. Por lo tanto, existe una fuerte demanda de los modelos animales. En comparación con la configuración de cultivo de células, en modelos in vivo puede proporcionarinformación valiosa sobre las redes multicelulares en el entorno de los huesos.

Existen numerosos modelos de ratón para una variedad de trastornos de los huesos humanos, incluyendo osteoporosis ^16. Sin embargo, el tamaño y la accesibilidad de los embriones de ratón representan limitaciones significativas para formación de imágenes en vivo de los procesos esqueléticos. Pequeños peces teleósteos, por otra parte, servir como una alternativa atractiva para formación de imágenes in vivo. El pez cebra (Danio rerio) y medaka (Oryzias latipes) se han convertido en modelos animales populares para la investigación del esqueleto en las últimas dos décadas ^{17, 19, 22, 24.} Bone en peces teleósteos y en los mamíferos es muy similar, tanto en un estructural y en un nivel fisiológico, y muchos de los genes reguladores clave y vías de señalización se conservan ^3. Como en los mamíferos, peces teleósteos regular cuidadosamente la actividad de los osteoblastos y osteoclastos para equilibrar la formación de hueso y la resorción ^26. Lo más importante, la claridad óptica de fish larvas permite el uso de indicadores fluorescentes para etiquetar las células óseas y de la matriz ósea calcificada ^{8, 9, 12, 21, 23,} lo que facilita la observación de procesos celulares en el animal vivo. Además, una serie de herramientas genéticas se ha generado para facilitar la investigación biomédica relevante en el pescado. Para medaka, en particular, los métodos para la mutación génica dirigida por CRISPR / Cas9 ^2, de células de linaje rastreo de ⁶ y específica del sitio transgénesis ¹⁴ se han establecido recientemente y ahora son ampliamente en uso ^15.

Pequeñas larvas de teleósteos se han utilizado con éxito para pantallas químicas, lo que llevó al descubrimiento de varios medicamentos farmacológicamente relevantes ^{1, 18.}

Las larvas de peces son tolerantes a bajas concentraciones de DMSO y son capaces de absorber compuestos de su medio ambiente acuático, ya sea a través de la piel o a través del tracto gastrointestinal ^{1, 5.} Nuestro laboratorio previamente representanteorted líneas medaka transgénicos que expresan reporteros fluorescentes en células de hueso bajo el control de diferentes promotores y osteoblast–osteoclastos específico. Estos incluyen los osteoblastos prematuros (10a1 colágeno, Col10a1; osterix, OSX) ^{20, 21,} osteoblastos maduros (osteocalcina, OSC) ^27, y los osteoclastos (catepsina K, ctsk) ^24. También generó una línea transgénica que expresa el factor de osteoclastos inductor activador del receptor de factor nuclear kappa B ligando (RANKL) bajo el control de un promotor de choque ²⁴ inducible por calor.

La inducción de RANKL en este sistema resulta en la formación ectópica de osteoclastos activos. Esto conduce a un aumento de la resorción ósea y una grave fenotipo osteoporosis similar, con reducido drásticamente la mineralización en los cuerpos vertebrales. Recientemente, hemos mostrado que la actividad de los osteoclastos en este modelo puede ser bloqueada por el etidronato y alendronato bifosfonatos, two Los medicamentos que se usan comúnmente en la terapia de la osteoporosis humana, validando así medaka como un sistema modelo adecuado para la osteoporosis ^27.

Debido a su gran tamaño de la camada, el rápido desarrollo, y el pequeño tamaño de los embriones, larvas medaka transgénico son especialmente adecuado para el cribado a gran escala de medicamentos para la osteoporosis y para el análisis in vivo de la conducta de las células óseas. Los estudios realizados en medaka por lo tanto pueden complementar de manera eficiente experimentos en cultivos celulares y en ratones que tienen como objetivo el descubrimiento de nuevas dianas terapéuticas y nuevas terapias para los trastornos óseos humanos.

En el presente estudio, se describe un protocolo para el tratamiento de las larvas de hueso-reportero medaka con el medicamento para la osteoporosis común, alendronato. También describimos en detalle cómo las larvas tratadas están montados y preparados para la formación de imágenes en vivo de la matriz ósea y de células óseas. Estos protocolos pueden ser adaptados fácilmente a otros compuestos químicos pequeños que, o bien el trabajo como anabólico óseo o fármacos antirresortivos. </ P>