Лечение наркомании и<em> В Vivo</em> Визуализация остеобластов-остеокластов взаимодействий в модели Оризии Рыба Остеопороз

Позвоночный каркас обеспечивает структурную поддержку и защиту органов, обеспечивающие мобильность, и служит в качестве источника кальция. На протяжении всей жизни, внеклеточный матрикс кости непрерывно перевернулась, чтобы поддерживать стабильность костной ткани и жесткость. Этот процесс требует сильно скоординированную деятельность и взаимодействие формирования костной остеобластов и костной резорбции остеокластов. Остеобласты получены из мезенхимальных стволовых клеток – предшественников и производят коллаген , чтобы сформировать остеоид белковый часть костной матрицы ^10. Остеобласты взаимодействуют с остеокластов для обеспечения сбалансированного активность обоих типов клеток, который необходим для контроля гомеостаза кости ^7. Из – за этих запутанных регуляторных взаимодействий, реакция на медикаментозное лечение и поддержании гомеостаза кости не может быть полностью изучены с помощью в пробирке исследования. Следовательно, существует большой спрос на животных моделях. По сравнению с установками для культивирования клеток, в естественных условиях модели могут обеспечитьценную информацию в многоклеточных сети в пределах окружающей среды кости.

Существует множество мышиные модели для различных заболеваний костей человека , включая остеопороз ^16. Тем не менее, размер и доступность эмбрионов мыши представляют собой существенные ограничения для живого изображения скелетных процессов. Малый костистых рыб, с другой стороны, служит в качестве привлекательной альтернативы для визуализации в естественных условиях. Рерио (Danio rerio) и оризии (Oryzias latipes) стали популярными моделями на животных для исследования скелета в течение последних двух десятилетий ^{17, 19, 22, 24.} Кости в костистых рыб и у млекопитающих очень похожи, как по структурным и на физиологическом уровне, и многие из ключевых регуляторных генов и сигнальных путей сохраняется ^3. Как и у млекопитающих, костистых рыб тщательно регулируют активность остеобластов и остеокластов , чтобы сбалансировать образование костной ткани и резорбции ^26. Самое главное, что оптическая прозрачность фиш Личинки позволяет использовать флуоресцентные репортеры маркировать костные клетки и кальцинированный скелетную матрицу ^{8, 9, 12, 21, 23,} что облегчает наблюдение клеточных процессов в живом организме животного. Кроме того, ряд генетических инструментов сгенерирована для облегчения биомедицины соответствующих исследований в рыбе. Для оризии , в частности, методов направленной мутации генов с помощью CrispR / cas9 ^2, клеточной линии прослеживания ⁶ и сайт-специфической трансгенез ¹⁴ были недавно созданы и в настоящее время широко используется ^15.

Малые личинки костистых были успешно использованы для химических экранов, которые привели к открытию нескольких фармакологически соответствующих препаратов ^{1, 18.}

Личинки рыб терпимы к низкой концентрации ДМСО и способны поглощать соединений из их водной среды, либо через кожу или через желудочно – кишечный тракт ^{1, 5.} Наша лаборатория ранее представительorted трансгенные линии оризии, которые выражают флуоресцентных репортерам в костных клеток под контролем различных osteoblast- и остеокластов конкретных промоутеров. К ним относятся преждевременные остеобласты (коллаген 10À1, col10a1; Osterix, OSX) ^{20, 21,} зрелые остеобласты (остеокальцина, OSC) ²⁷ и остеокластов (катепсина K, ctsk) ^24. Мы также генерироваться трансгенной линии, выражающую остеокластов индуцирующие рецептор фактора активатором ядерного фактора кВ лиганд (RANKL) под контролем теплового шока-индуцируемого промотора ^24.

Индукция RANKL в этой системе приводит к внематочной образованию активных остеокластов. Это приводит к увеличению костной резорбции и тяжелой остеопорозом, как фенотипа, с резко сниженной минерализацией в телах позвонков. Недавно мы показали, что активность остеокластов в этой модели может быть блокирован этидронатом и алендроната бисфосфонаты, ТВтO препараты , обычно используемые в терапии остеопороза человека, что подтверждает Оризии в качестве подходящей модельной системы для лечения остеопороза ^27.

Из – за их большого размера выводка, быстрое развитие, и небольшого размера эмбрионов, трансгенная личинки оризия уникально подходят для крупномасштабного скрининга остеопороза препаратов и для анализа в естественных условиях поведения костных клеток. Исследования, проведенные в оризии, таким образом, могут эффективно дополнять эксперименты на клеточных культурах и у мышей, которые направлены на выявление новых терапевтических целей и новых методов лечения для костных заболеваний человека.

В настоящем исследовании мы опишем протокол для лечения Оризии личинок костного репортера с общим остеопорозом препарата, алендроната. Мы также подробно описывают, как личинки очищенная смонтированы и подготовлены для живого изображения костной матрицы и костных клеток. Эти протоколы могут быть легко адаптированы к другим небольших химических соединений, которые либо работают в качестве костного анаболического или антирезорбтивными препаратами. </ Р>