접종<em> 아노 펠 레스 gambiae</emMelanization 면역 반응을 유도하고 측정하는 비즈> 모기
Summary
Through inoculation with beads, the described technique enables the stimulation of the mosquito melanization response in the hemolymph circulating system. The amount of melanin covering the beads can be measured after dissection as a measure of the immune response.
Abstract
면역 반응의 자극 효과와 면역 메커니즘을 조사하기 무척추 동물 연구에서 일반적인 도구입니다. 입자는 면역 시스템에 의해 감지되고 면역 이펙터의 생산을 유도하므로 본 자극, 곤충에 비병원성 입자의 주사에 기초한다. 우리는 모기 아노 펠 레스 gambiae에서 melanization 반응의 자극에 여기에 초점을 맞추고있다. 멜라닌의 어두운 층 이물질과 기생충의 캡슐화의 melanization 응답 결과. 이 반응을 자극하기 위해, 모기 유리 마이크로 모세관 튜브를 사용 흉강 구슬로 접종된다. 그 후, 24 시간 후, 모기 비드를 검색하는 해부된다. 비드 melanization의 정도는 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 측정된다. 비즈의 병원성 기생충 효과가 없거나 능력이 회피 또는 면역 반응을 억제. 이러한 주사 measu하는 방법면역 효능 및 생산력이나 장수 등의 생활사 특성에 면역 자극의 영향을 다시. 정확히 직접 호스트 기생충 상호 작용을 연구와 같은 것은 아니지만 면역 및 생태 진화 연구 흥미로운 도구이다.
Introduction
자신의 표피 또는 중장 상피 (4)를 통해 위반 3 – 곤충 기생충과 병원균 일에 대해 자신을 보호하는 면역 반응에 의존한다. 모기, 이러한 반응은 박테리아 5, 바이러스 6, filarial 선충 (7), 말라리아 기생충 1,8,9에 대한 효율적입니다. 12 – 모기에서 중요한 면역 반응 멜라닌 10 이물질이 밀봉된다. (12) -이 캡슐은 중장 또는 시스템 (10)을 순환 체액에 발생할 수 있습니다. 이 melanization 응답 친 phenoloxidase 결과 10 캐스케이드 – (12), 그리고 기생충의 사망 또는 식세포 작용을 초래할 수있다. 혈구 세포의 수를 제한 성인 모기에 melanization은 말라리아 기생충 또는 filarial 선충 7에 대해 같은 체액 성 반응이다.다른 곤충에서는 직접 7 melanize하는 기생충의 주위에 모이는 혈구 세포입니다. 또한, 멜라닌은 계란 생산 및 표피의 상처는 7 치유와 같은 여러 가지 다른 생리 학적 과정에 필수적이다.
18 – 면역 반응의 자극은 여러 농업과 공중 보건 모델 시스템 (13)에 곤충 내성을 연구하는 도구로 사용된다. 16, 19 -이 호스트 기생충 상호 작용 (14)를 공부 아노 펠 레스의 gambiae 모기, 아프리카에서 말라리아의 주요 벡터를 사용한다. 이러한 기술들은 패턴 인식 수용체 (PRR) 2 기생충을 검출하는 곤충의 용량에 기초한다. 모기는 또한 병원균 관련 분자 패턴 (PAMPs가) 그들의 생물학을 방해하는 다른 분자를 검출하거나, 콜라겐과 핵산의 출시로 인해 자신의 손상된 세포를 검출 할 수있다. 모기 면역 세포23 – 등의 혈구 세포 등의 검출 (20)에 사용됩니다. 주요 면역 신호 전달 경로는 IMD, 수신자, JAK / STAT (24)과 리보 핵산 간섭 (RNAi의) 25, 26. 유료 및 IMD 경로 모두 melanization 응답에 영향을 미치는와 프로 phenoloxidase와 상호 작용하는 10 계단식 – 12.
melanization 반응을 촉진하는 데 사용되는 표준 도구 흉강의 체액에 작은 비드 모기 접종이다. 멜라닌 캡슐화도는 모기의 절개를 통해 검색 한 후 비드 (19)를 측정 할 수있다. 대부분의 연구에서, 하나의 비드 모기 15,16,27 당 주입하지만, 더 비드를 주입하면 melanization 응답 (19)의 한계를 연구하기 위해 가능하다. 이러한 비드 모기 생리 방해를 제한하기 위해 주입 용액 (생리적 혈청)를 사용하여 주입되고모기 15,16,27의 탈수. 염료는 비드 선택을 쉽게하기 위해이 용액에 첨가된다. 이 비드 15,16,27을 검색하는 데 사용되는 박리 액에 대해 동일하다.
비병원성 자극 곤충 접종의 장점은 면역 반응에 대한 직접적인 효과에 집중하는 능력이다. 31, 또는 면역 회피 – 31 – 34 인해 기생충 병원성 (28), 면역 억제 (29)을 더 복잡하게 효과가 없습니다. 또한, 이러한 수명이나 생식력과 같은 다른 생활 역사 특성,에 자극의 결과도 연구 할 수있다. 따라서, 진화 생태학을 공부하는 연구자들은 이러한 도구 2,35,36이 필요할 수 있습니다. 예를 들어, 면역 도전 땅벌은 기아에서 단축 된 수명을 가지고있다. 면역 자극 및 배포 유사 부정적인 영향은 종종 짧은 결과, 다른 무척추 동물 모델에서 관찰되었다어 수명 이하 생식 성공 13,27,37. 이러한 연구는 다양한 환경 2,4,38에서 수행 될 수있다. 면역을 자극하면 면역 병리 (39, 40)에 직접 초점을 맞추고 그 관심이다.
이 프로토콜은 melanization 반응을 자극하고 직접 멜라닌의 양을 측정하는 모기 비드의 접종에 기초한다. 이것은 다른 실험 설정에서 melanization 응답의 양적 및 질적 연구를 할 수 있습니다. 이러한 도구는 예하는 항균 응답 등의 다른 면역 반응의 자극을 연장 할 수있는 박테리아 (41)를 가열 킬드. 또한 많은 생태 설정에서 수행 될 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 주입 기술은 자극하고 모기에 melanization 응답을 연구하는 데 유용합니다. 예를 들어, 우리가 면역 자극 부하의 효과를 연구 하였다.
이 절차의 중요한 단계가 제대로 모기을 접종하는 것입니다. 비행 근육 또는 모기 자체에 과도한 손상 공급에서 모기를 방지하거나 절개 전에 죽일 수 있습니다. 두 번째 중요한 단계 그들을 죽이지 않고 그들을 제압 할만큼 오래 얼음에 모?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was possible through funding from the University of Neuchâtel. We would like to thank all the students that helped in improving this technique, namely our colleague Kevin Thievent. We would also like to thank the members of the Thomas Lab for making their laboratory available. We would like to thank Janet Teeple for her help with mosquito rearing. We would also like to thanks Loyal Hall in the laboratory of Pr. Tom Baker for his help in the preparation of the micro capillary glass tubes.
Materials
| Microcapillary glass tubes GB120TF-10 | science-products.com | GB120TF-10 | http://www.science-products.com/Products/CatalogG/Glass/Glass.html |
| Microcaps Capillary pipette bulb | Drumond | 1-000-9000 | |
| negatively charged Sephadex CM C-25 beads | Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany | C25120 SIGMA | need few to start |
| Methyl green | Sigma-Aldrich | 323829 ALDRICH | need few to start |
| Software ImageJ | opensource | Version 1.47f7 or later |
References
- Dong, Y., Aguilar, R., Xi, Z., Warr, E., Mongin, E., Dimopoulos, G. Anopheles gambiae immune responses to human and rodent Plasmodium parasite species. PLoS pathog. 2 (6), e52 (2006).
- Sadd, B. M., Schmid-Hempel, P. PERSPECTIVE: Principles of ecological immunology. Evolutionary Appl. 2 (1), 113-121 (2008).
- Crompton, P. D., Moebius, J., et al. Malaria Immunity in Man and Mosquito: Insights into Unsolved Mysteries of a Deadly Infectious Disease*. Annu Rev Immuno. 32 (1), 157-187 (2014).
- Schmid-Hempel, P. EVOLUTIONARY ECOLOGY OF INSECT IMMUNE DEFENSES. Annu Rev Entomol. 50 (1), 529-551 (2005).
- Hillyer, J. F., Schmidt, S. L., Christensen, B. M. Rapid phagocytosis and melanization of bacteria and Plasmodium sporozoites by hemocytes of the mosquito Aedes aegypti. J parasito. 89 (1), 62-69 (2003).
- Carissimo, G., Pondeville, E., et al. Antiviral immunity of Anopheles gambiae is highly compartmentalized, with distinct roles for RNA interference and gut microbiota. PNAS. 112 (2), E176-E185 (2015).
- Christensen, B. M., Li, J., Chen, C. -. C., Nappi, A. J. Melanization immune responses in mosquito vectors. Trends parasito. 21 (4), 192-199 (2005).
- Collins, F., Sakai, R., et al. Genetic selection of a Plasmodium-refractory strain of the malaria vector Anopheles gambiae. Science. 234 (4776), 607-610 (1986).
- Warr, E., Lambrechts, L., Koella, J. C., Bourgouin, C., Dimopoulos, G. Anopheles gambiae immune responses to Sephadex beads: Involvement of anti-Plasmodium factors in regulating melanization. Insect Biochem Molec. 36 (10), 769-778 (2006).
- Fuchs, S., Behrends, V., Bundy, J. G., Crisanti, A., Nolan, T. Phenylalanine metabolism regulates reproduction and parasite melanization in the malaria mosquito. PloS one. 9 (1), e84865 (2014).
- Cerenius, L., Söderhäll, K. The prophenoloxidase-activating system in invertebrates. Immuno Rev. 198, 116-126 (2004).
- Cerenius, L., Lee, B. L., Söderhäll, K. The proPO-system: pros and cons for its role in invertebrate immunity. Trend Immuno. 29 (6), 263-271 (2008).
- Moret, Y., Schmid-Hempel, P. . Survival for immunity: the price of immune system activation for bumblebee workers. , 1166-1168 (2000).
- Suwanchaichinda, C., Paskewitz, S. M. Effects of Larval Nutrition, Adult Body Size, and Adult Temperature on the Ability of Anopheles gambiae(Diptera: Culicidae) to Melanize Sephadex Beads. J Med Entomol. 35 (2), 157-161 (1998).
- Chun, J., Riehle, M., Paskewitz, S. M. Effect of Mosquito Age and Reproductive Status on Melanization of Sephadex Beads in Plasmodium-Refractory and -Susceptible Strains of Anopheles gambiae. J Invertebr Pathol. 66 (1), 11-17 (1995).
- Schwartz, A., Koella, J. C. Melanization of Plasmodium falciparum and C-25 Sephadex Beads by Field-Caught Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae) from Southern Tanzania. J Med Entomol. 39 (1), 84-88 (2002).
- Zahedi, M., Denham, D. A., Ham, P. J. Encapsulation and melanization responses of Armigeres subalbatus against inoculated Sephadex beads. J Invertebr Pathol. 59 (3), 258-263 (1992).
- Laughton, A. M., Garcia, J. R., Altincicek, B., Strand, M. R., Gerardo, N. M. Characterisation of immune responses in the pea aphid, Acyrthosiphon pisum. J insect physiol. 57 (6), 830-839 (2011).
- Barreaux, A. M. G., Barreaux, P., Koella, J. C. Overloading the immunity of the mosquito Anopheles gambiae with multiple immune challenges. Parasite Vector. 9 (1), 210 (2016).
- Lazzaro, B. P., Rolff, J. Danger, Microbes, and Homeostasis. Science. 332 (6025), 43-44 (2011).
- Arrighi, R. B. G., Faye, I. Plasmodium falciparum GPI toxin: a common foe for man and mosquito. Acta trop. 114 (3), 162-165 (2010).
- Michel, K., Kafatos, F. C. Mosquito immunity against Plasmodium. Insect Biochem Molec. 35 (7), 677-689 (2005).
- Osta, M. A., Christophides, G. K., Vlachou, D., Kafatos, F. C. Innate immunity in the malaria vector Anopheles gambiae: comparative and functional genomics. J Exp Biol. 207 (15), 2551-2563 (2004).
- Christophides, G. K., Vlachou, D., Kafatos, F. C. Comparative and functional genomics of the innate immune system in the malaria vector Anopheles gambiae. Immunol Rev. 198 (1), 127-148 (2004).
- Blair, C. D. Mosquito RNAi is the major innate immune pathway controlling arbovirus infection and transmission. Future microbiol. 6 (3), 265-277 (2011).
- Fragkoudis, R., Attarzadeh-Yazdi, G., Nash, A. A., Fazakerley, J. K., Kohl, A. Advances in dissecting mosquito innate immune responses to arbovirus infection. J Gen Virol. , (2009).
- Schwartz, A., Koella, J. C. The cost of immunity in the yellow fever mosquito, Aedes aegypti depends on immune activation. J evol biol. 17 (4), 834-840 (2004).
- Lambrechts, L., Vulule, J. M., Koella, J. C. Genetic correlation between melanization and antibaterial immune responses in a natural population of the malaria vector Anopheles gambiae. Evolution. 58 (10), 2377 (2004).
- Boete, C., Paul, R. E. L., Koella, J. C. Direct and indirect immunosuppression by a malaria parasite in its mosquito vector. P Roy Soc B-Biol Sci. 271 (1548), 1611-1615 (2004).
- Sacks, D., Sher, A. Evasion of innate immunity by parasitic protozoa. Nat immunol. 3 (11), 1041-1047 (2002).
- Zambrano-Villa, S., Rosales-Borjas, D., Carrero, J. C., Ortiz-Ortiz, L. How protozoan parasites evade the immune response. Trend Parasito. 18 (6), 272-278 (2002).
- Damian, R. T. Parasite immune evasion and exploitation: reflections and projections. Parasitology. 115, S169-S175 (1997).
- Schmid-Hempel, P. Parasite immune evasion: a momentous molecular war. Trend ecol evol. 23 (6), 318-326 (2008).
- Schmid-Hempel, P. Immune defence, parasite evasion strategies and their relevance for "macroscopic phenomena" such as virulence. P Roy Soc B-Biol Sci. 364 (1513), 85-98 (2009).
- Stearns, S. C., Koella, J. C. The evolution of phenotypic plasticity in life history traits- predictions of reaction norms for age and size at maturity. Evolution. 40 (5), 893-913 (1986).
- Stearns, S. C. Life-history tactics: a review of the ideas. Q rev biol. 51 (1), 3-47 (1976).
- Valtonen, T. M., Kleino, A., Ramet, M., Rantala, M. J. Starvation Reveals Maintenance Cost of Humoral Immunity. Evol Biol. 37 (1), 49-57 (2010).
- Sheldon, B. C., Verhulst, S. Ecological immunology: costly parasite defences and trade-offs in evolutionary ecology. Trend Ecol Evo. 11 (8), 317-321 (1996).
- Graham, A. L., Allen, J. E., Read, A. F. Evolutionary causes and consequences of immunopathology. Annu Rev Ecol Evol S. 36, 373-397 (2005).
- Best, A., Long, G., White, A., Boots, M. The implications of immunopathology for parasite evolution. P Roy Soc B-Biol Sci. 279 (1741), 3234-3240 (2012).
- Cator, L. J., George, J., et al. 34;Manipulation" without the parasite: altered feeding behaviour of mosquitoes is not dependent on infection with malaria parasites. P Roy Soc B-Biol Sci. 280 (1763), 20130711 (2013).
- Voordouw, M. J., Lambrechts, L., Koella, J. No maternal effects after stimulation of the melanization response in the yellow fever mosquito Aedes aegypti. Oikos. 117 (8), 1269-1279 (2008).
- Paskewitz, S., Riehle, M. A. Response of Plasmodium refractory and susceptible strains of Anopheles gambiae to inoculated Sephadex beads. Dev comp immunol. 18 (5), 369-375 (1994).
