inoculant<em> Anopheles gambiae</em> Les moustiques avec perles à induire et mesurer la réponse immunitaire mélanisation
Summary
Through inoculation with beads, the described technique enables the stimulation of the mosquito melanization response in the hemolymph circulating system. The amount of melanin covering the beads can be measured after dissection as a measure of the immune response.
Abstract
La stimulation de la réponse immunitaire est un outil commun dans les études d'invertébrés afin d'examiner l'efficacité et les mécanismes de l'immunité. Cette stimulation est basée sur l'injection de particules non pathogènes dans les insectes, les particules seront détectés par le système immunitaire et induisent la production d'effecteurs immunitaires. Nous nous concentrons ici sur la stimulation de la réponse de la mélanisation chez le moustique Anopheles gambiae. Les résultats de la réponse de la mélanisation dans l'encapsulation de particules étrangères et les parasites avec une couche sombre de la mélanine. Pour stimuler cette réponse, les moustiques sont inoculées avec des billes dans la cavité thoracique à l'aide de tubes en verre microcapillaire. Puis, après 24 h, les moustiques sont disséquées pour récupérer les perles. Le degré de la mélanisation de la bille est mesurée en utilisant un logiciel d'analyse d'image. Perles ne possèdent pas les effets pathogènes des parasites, ou leur capacité à se soustraire ou suppriment la réponse immunitaire. Ces injections sont un moyen de mesure efficacité immunitaire et l'impact des stimulations immunitaires sur d'autres traits d'histoire de vie, tels que la fécondité ou la longévité. Il est pas exactement le même que l'étude directe des interactions hôte-parasite, mais il est un outil intéressant pour étudier l'immunité et de son écologie évolutive.
Introduction
Les insectes se fondent sur les réponses immunitaires pour se protéger contre les parasites et les agents pathogènes 1 – 3 tout abus par leur cuticule ou leur intestin épithélium 4. Dans les moustiques, ces réponses sont efficaces contre les bactéries, les virus 5 6, les nématodes filariens 7, et les parasites du paludisme 1,8,9. Dans les moustiques, une réponse immunitaire clé est l'encapsulation des particules étrangères avec la mélanine 10-12. Cette encapsulation peut se produire dans l'intestin ou dans le système de circulation hémolymphe 10-12. Cette réponse de mélanisation est le résultat de la pro-phenoloxidase cascade 10-12, et elle peut conduire à la mort des parasites ou à leur phagocytose. Dans les moustiques adultes, où le nombre de cellules hémocytes est limitée, mélanisation est une réponse humorale, comme contre les parasites Plasmodium ou nématodes filariens 7.Dans d'autres insectes, il est directement les cellules hémocytes qui se rassemblent autour du parasite pour les 7 melanize. En outre, la mélanine est également essentielle pour plusieurs autres processus physiologiques comme la production d'œufs et les plaies de la cuticule guérison 7.
La stimulation de la réponse immunitaire est utilisé comme un outil pour étudier l' immunité des insectes dans plusieurs systèmes modèles de santé publique agricole et 13 – 18. Il est utilisé dans Anopheles gambiae moustiques, le principal vecteur du paludisme en Afrique, pour étudier les interactions hôte-parasite 14 – 16,19. Ces techniques sont basées sur la capacité des insectes pour détecter des parasites avec leurs récepteurs de reconnaissance des formes (PRR) 2. Les moustiques peuvent également détecter d'autres molécules interférant avec leur biologie tels que les motifs moléculaires associés à des pathogènes (PAMP), ou de détecter leurs propres cellules endommagées en raison de la libération de collagène et d'acides nucléiques. La cellule immunitaire contre les moustiquess tels que les hémocytes sont utilisés pour la détection 20 – 23. Les principales voies de signalisation immunitaires sont Imd, Toll, JAK / STAT 24, et l' interférence de l' acide ribonucléique (ARNi) 25,26. Les deux voies Toll et Imd influencent la réponse de mélanisation et d' interagir avec le pro-phenoloxidase cascade 10-12.
L'outil standard utilisé pour stimuler la réponse de la mélanisation est l'inoculation d'un moustique avec une petite perle dans l'hémolymphe de la cavité thoracique. Le degré de mélanine encapsulation peut ensuite être mesurée 19 après avoir récupéré la perle à travers la dissection du moustique. Dans la plupart des études, une seule perle a été injecté par les moustiques 15,16,27, mais injectant plus de perles est possible afin d'étudier les limites de la réponse de la mélanisation 19. Ces billes sont injectées à l'aide d'une solution d'injection (sérum physiologique) afin de limiter la perturbation de la physiologie du moustique etla dessiccation du moustique 15,16,27. Un colorant est ajouté à cette solution pour faciliter la sélection de perles. Il en est de même pour la solution de dissection utilisé pour récupérer la 15,16,27 de billes.
L'avantage de inoculant insectes avec des stimuli non-pathogène est la capacité de se concentrer sur l'effet direct sur la réponse immunitaire. Il n'y a pas d' effets de complication due à parasite pathogénicité 28, immunosuppression 29-31, ou l' évasion immunitaire 31-34. En outre, les conséquences des stimulations sur d'autres traits d'histoire de vie, tels que la longévité ou la fécondité, peuvent également être étudiés. Ainsi, les chercheurs qui étudient l' écologie évolutive peuvent exiger de tels outils 2,35,36. Par exemple, les bourdons immunodéprimés contesté ont une durée de vie raccourcie sous la famine. effets négatifs similaires de stimulations immunitaires et les déploiements ont été observés dans différents modèles d'invertébrés, ce qui entraîne souvent une courteer la durée de vie ou moins de succès en matière de reproduction 13,27,37. De telles études peuvent être menées dans des environnements différents 2,4,38. Stimuler l' immunité est également d'intérêt pour ceux qui se concentrent directement sur immunopathologie 39,40.
Ce protocole est basé sur l'inoculation de perles avec des moustiques pour stimuler la réponse de la mélanisation et de mesurer directement la quantité de mélanine. Cela permet à l'étude quantitative et qualitative de la réponse mélanisation dans différents contextes expérimentaux. Un tel outil peut être étendue à la stimulation d'autres réponses immunes, telles que la réponse anti – bactérienne à des bactéries 41 tuées par la chaleur. Elle peut également être réalisée dans de nombreux contextes écologiques.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cette technique d'injection est utile pour stimuler et étudier la réponse de mélanisation chez les moustiques. Par exemple, ici, nous avons étudié l'effet de la charge stimuli immunitaire.
L'étape critique dans cette procédure consiste à inoculer correctement le moustique. Tous les dommages excessifs aux muscles de vol ou le moustique lui-même peut empêcher le moustique de l'alimentation ou peut le tuer avant la dissection. Une deuxième étape clé est de garder le…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was possible through funding from the University of Neuchâtel. We would like to thank all the students that helped in improving this technique, namely our colleague Kevin Thievent. We would also like to thank the members of the Thomas Lab for making their laboratory available. We would like to thank Janet Teeple for her help with mosquito rearing. We would also like to thanks Loyal Hall in the laboratory of Pr. Tom Baker for his help in the preparation of the micro capillary glass tubes.
Materials
| Microcapillary glass tubes GB120TF-10 | science-products.com | GB120TF-10 | http://www.science-products.com/Products/CatalogG/Glass/Glass.html |
| Microcaps Capillary pipette bulb | Drumond | 1-000-9000 | |
| negatively charged Sephadex CM C-25 beads | Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany | C25120 SIGMA | need few to start |
| Methyl green | Sigma-Aldrich | 323829 ALDRICH | need few to start |
| Software ImageJ | opensource | Version 1.47f7 or later |
References
- Dong, Y., Aguilar, R., Xi, Z., Warr, E., Mongin, E., Dimopoulos, G. Anopheles gambiae immune responses to human and rodent Plasmodium parasite species. PLoS pathog. 2 (6), e52 (2006).
- Sadd, B. M., Schmid-Hempel, P. PERSPECTIVE: Principles of ecological immunology. Evolutionary Appl. 2 (1), 113-121 (2008).
- Crompton, P. D., Moebius, J., et al. Malaria Immunity in Man and Mosquito: Insights into Unsolved Mysteries of a Deadly Infectious Disease*. Annu Rev Immuno. 32 (1), 157-187 (2014).
- Schmid-Hempel, P. EVOLUTIONARY ECOLOGY OF INSECT IMMUNE DEFENSES. Annu Rev Entomol. 50 (1), 529-551 (2005).
- Hillyer, J. F., Schmidt, S. L., Christensen, B. M. Rapid phagocytosis and melanization of bacteria and Plasmodium sporozoites by hemocytes of the mosquito Aedes aegypti. J parasito. 89 (1), 62-69 (2003).
- Carissimo, G., Pondeville, E., et al. Antiviral immunity of Anopheles gambiae is highly compartmentalized, with distinct roles for RNA interference and gut microbiota. PNAS. 112 (2), E176-E185 (2015).
- Christensen, B. M., Li, J., Chen, C. -. C., Nappi, A. J. Melanization immune responses in mosquito vectors. Trends parasito. 21 (4), 192-199 (2005).
- Collins, F., Sakai, R., et al. Genetic selection of a Plasmodium-refractory strain of the malaria vector Anopheles gambiae. Science. 234 (4776), 607-610 (1986).
- Warr, E., Lambrechts, L., Koella, J. C., Bourgouin, C., Dimopoulos, G. Anopheles gambiae immune responses to Sephadex beads: Involvement of anti-Plasmodium factors in regulating melanization. Insect Biochem Molec. 36 (10), 769-778 (2006).
- Fuchs, S., Behrends, V., Bundy, J. G., Crisanti, A., Nolan, T. Phenylalanine metabolism regulates reproduction and parasite melanization in the malaria mosquito. PloS one. 9 (1), e84865 (2014).
- Cerenius, L., Söderhäll, K. The prophenoloxidase-activating system in invertebrates. Immuno Rev. 198, 116-126 (2004).
- Cerenius, L., Lee, B. L., Söderhäll, K. The proPO-system: pros and cons for its role in invertebrate immunity. Trend Immuno. 29 (6), 263-271 (2008).
- Moret, Y., Schmid-Hempel, P. . Survival for immunity: the price of immune system activation for bumblebee workers. , 1166-1168 (2000).
- Suwanchaichinda, C., Paskewitz, S. M. Effects of Larval Nutrition, Adult Body Size, and Adult Temperature on the Ability of Anopheles gambiae(Diptera: Culicidae) to Melanize Sephadex Beads. J Med Entomol. 35 (2), 157-161 (1998).
- Chun, J., Riehle, M., Paskewitz, S. M. Effect of Mosquito Age and Reproductive Status on Melanization of Sephadex Beads in Plasmodium-Refractory and -Susceptible Strains of Anopheles gambiae. J Invertebr Pathol. 66 (1), 11-17 (1995).
- Schwartz, A., Koella, J. C. Melanization of Plasmodium falciparum and C-25 Sephadex Beads by Field-Caught Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae) from Southern Tanzania. J Med Entomol. 39 (1), 84-88 (2002).
- Zahedi, M., Denham, D. A., Ham, P. J. Encapsulation and melanization responses of Armigeres subalbatus against inoculated Sephadex beads. J Invertebr Pathol. 59 (3), 258-263 (1992).
- Laughton, A. M., Garcia, J. R., Altincicek, B., Strand, M. R., Gerardo, N. M. Characterisation of immune responses in the pea aphid, Acyrthosiphon pisum. J insect physiol. 57 (6), 830-839 (2011).
- Barreaux, A. M. G., Barreaux, P., Koella, J. C. Overloading the immunity of the mosquito Anopheles gambiae with multiple immune challenges. Parasite Vector. 9 (1), 210 (2016).
- Lazzaro, B. P., Rolff, J. Danger, Microbes, and Homeostasis. Science. 332 (6025), 43-44 (2011).
- Arrighi, R. B. G., Faye, I. Plasmodium falciparum GPI toxin: a common foe for man and mosquito. Acta trop. 114 (3), 162-165 (2010).
- Michel, K., Kafatos, F. C. Mosquito immunity against Plasmodium. Insect Biochem Molec. 35 (7), 677-689 (2005).
- Osta, M. A., Christophides, G. K., Vlachou, D., Kafatos, F. C. Innate immunity in the malaria vector Anopheles gambiae: comparative and functional genomics. J Exp Biol. 207 (15), 2551-2563 (2004).
- Christophides, G. K., Vlachou, D., Kafatos, F. C. Comparative and functional genomics of the innate immune system in the malaria vector Anopheles gambiae. Immunol Rev. 198 (1), 127-148 (2004).
- Blair, C. D. Mosquito RNAi is the major innate immune pathway controlling arbovirus infection and transmission. Future microbiol. 6 (3), 265-277 (2011).
- Fragkoudis, R., Attarzadeh-Yazdi, G., Nash, A. A., Fazakerley, J. K., Kohl, A. Advances in dissecting mosquito innate immune responses to arbovirus infection. J Gen Virol. , (2009).
- Schwartz, A., Koella, J. C. The cost of immunity in the yellow fever mosquito, Aedes aegypti depends on immune activation. J evol biol. 17 (4), 834-840 (2004).
- Lambrechts, L., Vulule, J. M., Koella, J. C. Genetic correlation between melanization and antibaterial immune responses in a natural population of the malaria vector Anopheles gambiae. Evolution. 58 (10), 2377 (2004).
- Boete, C., Paul, R. E. L., Koella, J. C. Direct and indirect immunosuppression by a malaria parasite in its mosquito vector. P Roy Soc B-Biol Sci. 271 (1548), 1611-1615 (2004).
- Sacks, D., Sher, A. Evasion of innate immunity by parasitic protozoa. Nat immunol. 3 (11), 1041-1047 (2002).
- Zambrano-Villa, S., Rosales-Borjas, D., Carrero, J. C., Ortiz-Ortiz, L. How protozoan parasites evade the immune response. Trend Parasito. 18 (6), 272-278 (2002).
- Damian, R. T. Parasite immune evasion and exploitation: reflections and projections. Parasitology. 115, S169-S175 (1997).
- Schmid-Hempel, P. Parasite immune evasion: a momentous molecular war. Trend ecol evol. 23 (6), 318-326 (2008).
- Schmid-Hempel, P. Immune defence, parasite evasion strategies and their relevance for "macroscopic phenomena" such as virulence. P Roy Soc B-Biol Sci. 364 (1513), 85-98 (2009).
- Stearns, S. C., Koella, J. C. The evolution of phenotypic plasticity in life history traits- predictions of reaction norms for age and size at maturity. Evolution. 40 (5), 893-913 (1986).
- Stearns, S. C. Life-history tactics: a review of the ideas. Q rev biol. 51 (1), 3-47 (1976).
- Valtonen, T. M., Kleino, A., Ramet, M., Rantala, M. J. Starvation Reveals Maintenance Cost of Humoral Immunity. Evol Biol. 37 (1), 49-57 (2010).
- Sheldon, B. C., Verhulst, S. Ecological immunology: costly parasite defences and trade-offs in evolutionary ecology. Trend Ecol Evo. 11 (8), 317-321 (1996).
- Graham, A. L., Allen, J. E., Read, A. F. Evolutionary causes and consequences of immunopathology. Annu Rev Ecol Evol S. 36, 373-397 (2005).
- Best, A., Long, G., White, A., Boots, M. The implications of immunopathology for parasite evolution. P Roy Soc B-Biol Sci. 279 (1741), 3234-3240 (2012).
- Cator, L. J., George, J., et al. 34;Manipulation" without the parasite: altered feeding behaviour of mosquitoes is not dependent on infection with malaria parasites. P Roy Soc B-Biol Sci. 280 (1763), 20130711 (2013).
- Voordouw, M. J., Lambrechts, L., Koella, J. No maternal effects after stimulation of the melanization response in the yellow fever mosquito Aedes aegypti. Oikos. 117 (8), 1269-1279 (2008).
- Paskewitz, S., Riehle, M. A. Response of Plasmodium refractory and susceptible strains of Anopheles gambiae to inoculated Sephadex beads. Dev comp immunol. 18 (5), 369-375 (1994).
