het enten<em> Anopheles gambiae</em> Muggen met kralen te induceren en Meet de melanisatie immuunrespons
Summary
Through inoculation with beads, the described technique enables the stimulation of the mosquito melanization response in the hemolymph circulating system. The amount of melanin covering the beads can be measured after dissection as a measure of the immune response.
Abstract
Het stimuleren van immuunresponsen is een gemeenschappelijk instrument in ongewervelde studies om de werkzaamheid en de mechanismen van immuniteit onderzocht. Deze stimulatie is gebaseerd op de injectie van niet-pathogene deeltjes in insecten, aangezien de deeltjes gedetecteerd worden door het immuunsysteem en de productie van immuuneffectoren induceren. Wij richten ons hier op de stimulatie van de melanisatie respons in de mug Anopheles gambiae. De melanisatie reactie resulteert in de inkapseling van vreemde deeltjes en parasieten met een donkere laag van melanine. Om deze reactie te bevorderen, worden muggen geïnoculeerd met kralen in de borstholte via microcapillaire glazen buizen. Dan, na 24 uur, de muggen worden ontleed om de kralen te halen. De mate van melanisatie van de parel wordt gemeten met beeldanalyse software. Kralen niet de pathogene effecten van parasieten of hun vermogen te ontwijken of onderdrukken de immuunreactie. Deze injecties zijn een manier om measure immuun doeltreffendheid en de impact van het immuunsysteem stimuleringen op andere levensgeschiedeniskenmerken, zoals vruchtbaarheid of levensduur. Het is niet precies hetzelfde als direct bestuderen van gastheer-parasiet interacties, maar het is een interessant instrument om de immuniteit en de evolutionaire ecologie te bestuderen.
Introduction
Insecten afhankelijk immuunreacties om zich te beschermen tegen parasieten en pathogenen 1-3 schenden die door hun cuticula of hun middendarm epitheel 4. In muggen, deze reacties zijn efficiënt tegen bacteriën 5, virussen 6, filarial nematoden 7 en malariaparasieten 1,8,9. Muggen, een belangrijke immuunrespons is het inkapselen van deeltjes met melanine 10-12. Deze inkapseling kan gebeuren in de middendarm of de hemolymfe circulatiesysteem 10-12. Dit melanisatie reactie is het gevolg van de pro-fenoloxidasesubstraat cascade 10-12, en kan leiden tot de dood van de parasieten of hun fagocytose. Bij volwassen muskieten, waarbij het aantal cellen hemocytes beperkt, melanisatie een humorale respons, zoals tegen plasmodium parasieten of filarial nematoden 7.In sommige andere insecten, het ligt direct aan de hemocytes cellen die zich verzamelen rond de parasiet om ze 7 melanize. Trouwens, melanine is ook essentieel voor een aantal andere fysiologische processen, zoals de productie van eieren en cuticula wonden helen van 7.
Het stimuleren van immuunresponsen wordt gebruikt als een middel om insecten immuniteit bestuderen in verscheidene landbouw- en volksgezondheid modelsystemen 13-18. Het wordt gebruikt in Anopheles gambiae muggen, de belangrijkste vector van malaria in Afrika, gastheer-parasiet interacties 14 bestuderen – 16,19. Deze technieken zijn gebaseerd op het vermogen van insecten detecteren van parasieten met hun patroonherkenning receptoren (PRR) 2. Muggen kunnen ook detecteren andere moleculen interfereren met hun biologische als pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen (PAMPs) of detecteren eigen beschadigde cellen door het vrijkomen van collageen en nucleïnezuren. De mug immuuncels zoals hemocytes worden gebruikt voor detectie 20-23. De belangrijkste immuun signaalwegen zijn IMD Toll, JAK / STAT 24 en ribonucleïnezuur interferentie (RNAi) 25,26. Zowel Toll en Imd paden invloed op de melanisatie respons en interactie met de pro-fenoloxidasesubstraat cascade 10-12.
De standaard instrument dat wordt gebruikt om de melanisatie reactie te bevorderen is het inenten van een mug met een kleine kraal in de hemolymfe van de borstholte. De mate van melanine inkapseling kan dan worden gemeten 19 na het ophalen van de kraal door de dissectie van de mug. In de meeste studies werd slechts één kraal geïnjecteerd per mug 15,16,27, maar met groter beads mogelijk om de grenzen van de melanisatie reactie 19 bestuderen. Deze kralen worden geïnjecteerd met een injectieoplossing (fysiologisch serum) verstoring van de mug fysiologie beperken ende verdroging van de mug 15,16,27. Een kleurstof wordt toegevoegd aan deze oplossing tot hiel selectie vergemakkelijken. Het is hetzelfde voor de dissectie is gebruikt voor de kraal 15,16,27 halen.
Het voordeel van insecten enten met niet-pathogene stimuli is het vermogen zich te concentreren op het directe effect op de immuunrespons. Er zijn geen complicerende effecten als gevolg van parasieten pathogene 28, immunosuppressie 29-31, of immuun belastingontduiking 31-34. Trouwens, de gevolgen van de stimuleringen op andere levensgeschiedenis eigenschappen, zoals duurzaamheid of vruchtbaarheid, kan ook worden bestudeerd. Zo kunnen onderzoekers bestuderen de evolutionaire ecologie dergelijke instrumenten 2,35,36 vereisen. Bijvoorbeeld-immuno uitgedaagd hommels hebben een verkorte levensduur onder hongersnood. Dezelfde negatieve effecten van immune stimulatie en implementaties zijn waargenomen bij verschillende ongewervelde modellen, vaak resulterend in een korteer levensduur of minder voortplantingssucces 13,27,37. Dergelijke studies kunnen worden uitgevoerd in verschillende omgevingen 2,4,38. Het stimuleren van de immuniteit is ook van belang voor degenen die direct gericht op immunopathologie 39,40.
Dit protocol is gebaseerd op de inoculatie van kralen met muggen melanisatie de reactie te bevorderen en is rechtstreeks meet de hoeveelheid melanine. Hierdoor kwantitatieve en kwalitatieve studie van de melanisatie respons in verschillende experimentele instellingen. Zo'n instrument kan worden uitgebreid tot het stimuleren van andere immuunresponsen, zoals antibacteriële reactie op warmte-gedode bacteriën 41. Het kan ook worden uitgevoerd in vele ecologische instellingen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Deze injectie techniek is handig te stimuleren en de studie van de melanisatie reactie in muggen. Bijvoorbeeld, hier hebben we het effect van het immuunsysteem stimuli belasting.
De kritische stap in deze procedure is om de mug goed inoculeren. Buitensporige schade aan de vlucht spieren of de mug zelf kan de mug uit voeding te voorkomen of kan het doden voordat de dissectie. Een tweede belangrijke stap is om de muggen op ijs lang genoeg om ze knock-out zonder ze te doden houden. Een kleine c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was possible through funding from the University of Neuchâtel. We would like to thank all the students that helped in improving this technique, namely our colleague Kevin Thievent. We would also like to thank the members of the Thomas Lab for making their laboratory available. We would like to thank Janet Teeple for her help with mosquito rearing. We would also like to thanks Loyal Hall in the laboratory of Pr. Tom Baker for his help in the preparation of the micro capillary glass tubes.
Materials
| Microcapillary glass tubes GB120TF-10 | science-products.com | GB120TF-10 | http://www.science-products.com/Products/CatalogG/Glass/Glass.html |
| Microcaps Capillary pipette bulb | Drumond | 1-000-9000 | |
| negatively charged Sephadex CM C-25 beads | Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany | C25120 SIGMA | need few to start |
| Methyl green | Sigma-Aldrich | 323829 ALDRICH | need few to start |
| Software ImageJ | opensource | Version 1.47f7 or later |
References
- Dong, Y., Aguilar, R., Xi, Z., Warr, E., Mongin, E., Dimopoulos, G. Anopheles gambiae immune responses to human and rodent Plasmodium parasite species. PLoS pathog. 2 (6), e52 (2006).
- Sadd, B. M., Schmid-Hempel, P. PERSPECTIVE: Principles of ecological immunology. Evolutionary Appl. 2 (1), 113-121 (2008).
- Crompton, P. D., Moebius, J., et al. Malaria Immunity in Man and Mosquito: Insights into Unsolved Mysteries of a Deadly Infectious Disease*. Annu Rev Immuno. 32 (1), 157-187 (2014).
- Schmid-Hempel, P. EVOLUTIONARY ECOLOGY OF INSECT IMMUNE DEFENSES. Annu Rev Entomol. 50 (1), 529-551 (2005).
- Hillyer, J. F., Schmidt, S. L., Christensen, B. M. Rapid phagocytosis and melanization of bacteria and Plasmodium sporozoites by hemocytes of the mosquito Aedes aegypti. J parasito. 89 (1), 62-69 (2003).
- Carissimo, G., Pondeville, E., et al. Antiviral immunity of Anopheles gambiae is highly compartmentalized, with distinct roles for RNA interference and gut microbiota. PNAS. 112 (2), E176-E185 (2015).
- Christensen, B. M., Li, J., Chen, C. -. C., Nappi, A. J. Melanization immune responses in mosquito vectors. Trends parasito. 21 (4), 192-199 (2005).
- Collins, F., Sakai, R., et al. Genetic selection of a Plasmodium-refractory strain of the malaria vector Anopheles gambiae. Science. 234 (4776), 607-610 (1986).
- Warr, E., Lambrechts, L., Koella, J. C., Bourgouin, C., Dimopoulos, G. Anopheles gambiae immune responses to Sephadex beads: Involvement of anti-Plasmodium factors in regulating melanization. Insect Biochem Molec. 36 (10), 769-778 (2006).
- Fuchs, S., Behrends, V., Bundy, J. G., Crisanti, A., Nolan, T. Phenylalanine metabolism regulates reproduction and parasite melanization in the malaria mosquito. PloS one. 9 (1), e84865 (2014).
- Cerenius, L., Söderhäll, K. The prophenoloxidase-activating system in invertebrates. Immuno Rev. 198, 116-126 (2004).
- Cerenius, L., Lee, B. L., Söderhäll, K. The proPO-system: pros and cons for its role in invertebrate immunity. Trend Immuno. 29 (6), 263-271 (2008).
- Moret, Y., Schmid-Hempel, P. . Survival for immunity: the price of immune system activation for bumblebee workers. , 1166-1168 (2000).
- Suwanchaichinda, C., Paskewitz, S. M. Effects of Larval Nutrition, Adult Body Size, and Adult Temperature on the Ability of Anopheles gambiae(Diptera: Culicidae) to Melanize Sephadex Beads. J Med Entomol. 35 (2), 157-161 (1998).
- Chun, J., Riehle, M., Paskewitz, S. M. Effect of Mosquito Age and Reproductive Status on Melanization of Sephadex Beads in Plasmodium-Refractory and -Susceptible Strains of Anopheles gambiae. J Invertebr Pathol. 66 (1), 11-17 (1995).
- Schwartz, A., Koella, J. C. Melanization of Plasmodium falciparum and C-25 Sephadex Beads by Field-Caught Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae) from Southern Tanzania. J Med Entomol. 39 (1), 84-88 (2002).
- Zahedi, M., Denham, D. A., Ham, P. J. Encapsulation and melanization responses of Armigeres subalbatus against inoculated Sephadex beads. J Invertebr Pathol. 59 (3), 258-263 (1992).
- Laughton, A. M., Garcia, J. R., Altincicek, B., Strand, M. R., Gerardo, N. M. Characterisation of immune responses in the pea aphid, Acyrthosiphon pisum. J insect physiol. 57 (6), 830-839 (2011).
- Barreaux, A. M. G., Barreaux, P., Koella, J. C. Overloading the immunity of the mosquito Anopheles gambiae with multiple immune challenges. Parasite Vector. 9 (1), 210 (2016).
- Lazzaro, B. P., Rolff, J. Danger, Microbes, and Homeostasis. Science. 332 (6025), 43-44 (2011).
- Arrighi, R. B. G., Faye, I. Plasmodium falciparum GPI toxin: a common foe for man and mosquito. Acta trop. 114 (3), 162-165 (2010).
- Michel, K., Kafatos, F. C. Mosquito immunity against Plasmodium. Insect Biochem Molec. 35 (7), 677-689 (2005).
- Osta, M. A., Christophides, G. K., Vlachou, D., Kafatos, F. C. Innate immunity in the malaria vector Anopheles gambiae: comparative and functional genomics. J Exp Biol. 207 (15), 2551-2563 (2004).
- Christophides, G. K., Vlachou, D., Kafatos, F. C. Comparative and functional genomics of the innate immune system in the malaria vector Anopheles gambiae. Immunol Rev. 198 (1), 127-148 (2004).
- Blair, C. D. Mosquito RNAi is the major innate immune pathway controlling arbovirus infection and transmission. Future microbiol. 6 (3), 265-277 (2011).
- Fragkoudis, R., Attarzadeh-Yazdi, G., Nash, A. A., Fazakerley, J. K., Kohl, A. Advances in dissecting mosquito innate immune responses to arbovirus infection. J Gen Virol. , (2009).
- Schwartz, A., Koella, J. C. The cost of immunity in the yellow fever mosquito, Aedes aegypti depends on immune activation. J evol biol. 17 (4), 834-840 (2004).
- Lambrechts, L., Vulule, J. M., Koella, J. C. Genetic correlation between melanization and antibaterial immune responses in a natural population of the malaria vector Anopheles gambiae. Evolution. 58 (10), 2377 (2004).
- Boete, C., Paul, R. E. L., Koella, J. C. Direct and indirect immunosuppression by a malaria parasite in its mosquito vector. P Roy Soc B-Biol Sci. 271 (1548), 1611-1615 (2004).
- Sacks, D., Sher, A. Evasion of innate immunity by parasitic protozoa. Nat immunol. 3 (11), 1041-1047 (2002).
- Zambrano-Villa, S., Rosales-Borjas, D., Carrero, J. C., Ortiz-Ortiz, L. How protozoan parasites evade the immune response. Trend Parasito. 18 (6), 272-278 (2002).
- Damian, R. T. Parasite immune evasion and exploitation: reflections and projections. Parasitology. 115, S169-S175 (1997).
- Schmid-Hempel, P. Parasite immune evasion: a momentous molecular war. Trend ecol evol. 23 (6), 318-326 (2008).
- Schmid-Hempel, P. Immune defence, parasite evasion strategies and their relevance for "macroscopic phenomena" such as virulence. P Roy Soc B-Biol Sci. 364 (1513), 85-98 (2009).
- Stearns, S. C., Koella, J. C. The evolution of phenotypic plasticity in life history traits- predictions of reaction norms for age and size at maturity. Evolution. 40 (5), 893-913 (1986).
- Stearns, S. C. Life-history tactics: a review of the ideas. Q rev biol. 51 (1), 3-47 (1976).
- Valtonen, T. M., Kleino, A., Ramet, M., Rantala, M. J. Starvation Reveals Maintenance Cost of Humoral Immunity. Evol Biol. 37 (1), 49-57 (2010).
- Sheldon, B. C., Verhulst, S. Ecological immunology: costly parasite defences and trade-offs in evolutionary ecology. Trend Ecol Evo. 11 (8), 317-321 (1996).
- Graham, A. L., Allen, J. E., Read, A. F. Evolutionary causes and consequences of immunopathology. Annu Rev Ecol Evol S. 36, 373-397 (2005).
- Best, A., Long, G., White, A., Boots, M. The implications of immunopathology for parasite evolution. P Roy Soc B-Biol Sci. 279 (1741), 3234-3240 (2012).
- Cator, L. J., George, J., et al. 34;Manipulation" without the parasite: altered feeding behaviour of mosquitoes is not dependent on infection with malaria parasites. P Roy Soc B-Biol Sci. 280 (1763), 20130711 (2013).
- Voordouw, M. J., Lambrechts, L., Koella, J. No maternal effects after stimulation of the melanization response in the yellow fever mosquito Aedes aegypti. Oikos. 117 (8), 1269-1279 (2008).
- Paskewitz, S., Riehle, M. A. Response of Plasmodium refractory and susceptible strains of Anopheles gambiae to inoculated Sephadex beads. Dev comp immunol. 18 (5), 369-375 (1994).
