בהיפוקמפוס ראשי בצפיפות נמוכה תרבות Neuron
Summary
מאמר זה מתאר את הפרוטוקול עבור culturing נוירונים בהיפוקמפוס העיקריים בצפיפות נמוכה גדלו על coverslips הזכוכית הפוך מעל בשכבת גליה. שכבות הנוירון גליה מופרדות חרוזי פראפין. הנוירונים גדלו על ידי שיטה זו מתאימים הדמיה אופטית מבחנים תפקודיים ברזולוציה גבוהה.
Abstract
היכולת לחקור את המבנה והפיזיולוגיה של תאי עצב בודדים בתרבות חיונית לחקר בנוירוביולוגיה, מקנה גמישות מניפולציה גנטית וכימי של תאים בודדים או רשתות מוגדרות. הקלות של מניפולציה כזו היא פשוטה במערכת התרבות המופחתת בהשוואת רקמת המוח השלמה. בעוד שיטות רבות עבור הבידוד והצמיחה של הנוירונים העיקריים האלה קיימות, לכל אחד מהם יש מגבלות משלה. פרוטוקול זה מתאר שיטה culturing נוירונים בהיפוקמפוס עובריים בצפיפות נמוכה גבוהה טוהר מכרסם על coverslips זכוכית, אשר מושעים אז מעל בשכבה של תאי גליה. זו "תרבות הכריך" מאפשרת לצמיחה ארוך טווח בלעדי של אוכלוסייה של נוירונים ובה בעת לאפשר תמיכה טרופית מן בשכבת גליה הבסיסית. כאשר הנוירונים הם גילו מספיק או לרמת בשלות, את coverslips נוירון ניתן ודפוק של מנת גליה ו המשמש להדמיה או מבחנים תפקודיים. נוירונים grown בשיטה זו בדרך כלל לשרוד במשך כמה שבועות ולפתח סוכות נרחבות, קשרים סינפטיים, ואת מאפייני רשת.
Introduction
המוח מאורגן רשתות מורכבות של נוירונים. תרומתו של נוירונים בודדים לפעילות הרשת תפקוד המוח יכול להיחקר על ידי שינוי סלקטיבית של ההרכב המולקולרי שלהם perturbance של המאפיינים הפיזיולוגיים שלהם. מניפולציה גנטית וכימית של נוירונים בודדים היא ללא ספק קל יותר ב נוירונים בתרבית מאשר רקמת מוח שלמה, משוחרר על ידי ההטרוגניות המורכבות הסלולר של האחרונים. נוירונים בתרבית לפתח אקסונלית מוגדרת היטב סוכות דנדריטים וליצור קשרים סינפטיים נרחבים עם שני.
בעוד נוירון תרבות מחיות מבוגרות או מאזורים אחרים של מערכת העצבים אפשרית, תרבויות בהיפוקמפוס עובריות הם העדיפו לעתים קרובות בשל אוכלוסיית תאי פירמידליים המוגדרת שלהם וצפיפות גליה נמוכה יחסית 1, 2. נוירונים בהיפוקמפוס גדל בצפיפות נמוכה בתרבות במיוחד AMENable ללימוד לוקליזציה subcellular, סחר חלבון, קוטביות עצבית ופיתוח סינפסה. נוירונים בתרבית גם הועסק נרחב בלימוד תהליכים מולקולריים הפלסטיות הסינפטית 3, 4, 5, 6. הכנות תרבות Neuron מעכברים עם מחיקות גנטיות עולמיות כי אינו שורד לאחר לידה כבר שימושיות במיוחד בלימוד התפקידים הסלולר סינפטיים של גנים מסוימים 7.
כמו במוח, נוירונים בהיפוקמפוס תרבותיים תלויים תמיכה טרופית מתא גליה. זה מסבך את התרבות שלהם, והוא הוביל את הפיתוח של מספר שיטות שונות שבאמצעותם תמיכה זו מסופקת. אחת שיטות נפוצות כרוכות ציפוי נוירונים ישירות על בשכבה של תאי גליה 8, או המאפשר ותאי גלייה מזהמים מן Hipp רכשהרקמת ocampal להתרבות וליצור בשכבה מתחת נוירונים 9. אמנם שיטה זו מצאה כמה הצלחה, הטומאה של התרבות העצבית וכתוצאה היא נחה עבור ניסויי הדמיה. שיטה נפוצה נוספת של תרבות נוירון היא לעזוב-אאוט המזין גליה שכבה לגמרי, ובמקום לספק תמיכה טרופית בצורת מדיום גידול מוגדר 10.
כאן, אנו מתארים את "כריך" או "בנקר" השיטה של נוירון תרבות 2, 11. שיטה זו כרוכה ציפוי נוירונים בהיפוקמפוס על coverslips זכוכית, אשר מושעים אז מעל בשכבה של תאי גליה מופרדים חרוזי פראפין. זה מקל על תרבות ארוכת טווח של אוכלוסייה הומוגנית של נוירונים מבלי לזהם גליה ובה בעת לאפשר תמיכה טרופית מן בשכבת גליה הבסיסית. כאשר הנוירונים הם גילו מספיק או רמת בגרות,ניתן והדפוק את coverslips נוירון של מנת גליה ו המשמש להדמיה או מבחנים תפקודיים.
Protocol
Representative Results
Discussion
בעוד השיטה "כריך" של נוירונים culturing כבר היטב תיאר במקום 2, 11, ישנם מספר צעדים בכל פרוטוקול כי הם די קשה לתאר בצורה של טקסט בלבד, מה שעלול להוביל לתסכול עבור חוקרים המבקשים לאמץ אותו.
השיטה ניתן לח…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי MOP-142,209 CIHR כדי TJS.
Materials
| Dissection Instruments | |||
| Micro Dissecting Scissors | Roboz | RS-5910 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz | RS-5650 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz | RS-5605 | |
| Dumont Forceps (#5) | Roboz | RS-5045 | |
| Dumont Forceps (#PP) | Roboz | RS-4950 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Preparation | |||
| Trypsin (2.5%) | Gibco | 15-090-046 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25-200-072 | |
| Swinnex Filter Holder, 25 mm | EMD Millipore | SX0002500 | Used as cell strainer. Assemble first with filter and autoclave |
| Isoflorane | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | CP0406V2 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
| Grade 105 Lens Cleaning Tissue | GE Healthcare | 2105-841 | Used as cell strainer. Assemble first in filter holder and autoclave |
| Glass Pasteur pipettes with cotton filter | VWR | 14672-412 | |
| HEPES (1 M) | Gibco | 15-630-080 | |
| Hank's Balanced Salt Solution without Calcium, Magnesium, Phenol Red (HBSS, 10x) | Gibco | 14-185-052 | |
| Glass Pasteur pipettes | VWR | 14672-380 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (Dnase) | Sigma-Aldrich | DN25-100mg | |
| Butane bunsen burner | Wall-Lenk Mfg. Co. | Model 65 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Culture | |||
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15-140-122 | |
| Petri Dish (100 mm) | Fisher | FB0875712 | |
| Petri Dish (60 mm) | Fisher | FB0875713A | |
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | Can be used in place of BGS, but each lot must be tested due to inter-lot variation. Heat-inactivation of serum is recommended. |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-1 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) | Gibco | 11-095-080 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21-103-049 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25-030-081 | |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | Can be used in place of L-Glutamine in the NBG medium |
| Culture Dish (60 mm) | Corning, Inc | 353002 | |
| Culture Flasks (75 cm^2) | Greiner Bio-One | 658170 | |
| Cytarabine (Ara-C) | Sigma-Aldrich | C3350000 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Bovine Growth Serum (BGS) | HyClone | SH3054103 | Heat-inactivation is recommended before use. |
| B27 Supplement (50x) | Gibco | 17-504-044 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418-100ml | |
| Cryogenic Vials | VWR | 89094-806 | |
| DL-2-Amino-5-phosphonopentanoic acid (APV) | Sigma-Aldrich | A5282 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coverslip Preparation | |||
| Sodium tetraborate decahydrate (borax) | Sigma-Aldrich | B9876-1KG | |
| Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| Histoplast Paraffin Wax | Fisher | 22-900-700 | |
| Gravity Convection Oven | VWR | 89511-404 | Used for alternative coverslip cleaning method discussed in protocol |
| Ultrasonic Bath (Sonicator) | Fisher Scientific | 15337400 | |
| Nitric Acid | Anachemia | 62786-460 | |
| Ceramic Staining Racks | Thomas Scientific | 8542E40 | Used for alternative coverslip cleaning method discussed in protocol |
| Coverslips | Glaswarenfabrik Karl Hecht GmbH | 1001/18 | Manufacturer is very important, as neurons do not adhere well to lower quality glass |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B0252 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Miscellaneous | |||
| Sterile Syringe Filters | VWR | 28145-477 | Used with BD syringe for filter-sterilization |
| Syringe | BD | 302832 | Used with VWR sterile syringe filters for fliter-sterilization |
| Water Bath | Fisher Scientific | 15-460-16Q | |
| Inverted Microscope | Olympus | CKX41 | |
| 15 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes | ThermoScientific | 339650 | |
| 50 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes | ThermoScientific | 339652 |
References
- Banker, G. A., Cowan, W. M. Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain Res. 126, 397-425 (1977).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Adamantidis, A., et al. Optogenetics: 10 years after ChR2 in neurons–views from the community. Nat Neurosci. 18, 1202-1212 (2015).
- Ho, V. M., Lee, J. A., Martin, K. C. The cell biology of synaptic plasticity. Science. 334, 623-628 (2011).
- Huganir, R. L., Nicoll, R. A. AMPARs and synaptic plasticity: the last 25 years. Neuron. 80, 704-717 (2013).
- Luscher, C., et al. Role of AMPA receptor cycling in synaptic transmission and plasticity. Neuron. 24, 649-658 (1999).
- Varoqueaux, F., et al. Neuroligins determine synapse maturation and function. Neuron. 51, 741-754 (2006).
- Huettner, J. E., Baughman, R. W. Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats. J Neurosci. 6, 3044-3060 (1986).
- Lester, R. A., Quarum, M. L., Parker, J. D., Weber, E., Jahr, C. E. Interaction of 6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione with the N-methyl-D-aspartate receptor-associated glycine binding site. Mol Pharmacol. 35, 565-570 (1989).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35, 567-576 (1993).
- Goslin, K., Asmussen, H., Banker, G., Banker, G., Goslin, K. Rat hippocampal neurons in low-density culture. Culturing nerve cells. 2, 339-370 (1998).
- Hanisch, U. K. Microglia as a source and target of cytokines. Glia. 40, 140-155 (2002).
