Summary

בהיפוקמפוס ראשי בצפיפות נמוכה תרבות Neuron

Published: April 18, 2017
doi:

Summary

מאמר זה מתאר את הפרוטוקול עבור culturing נוירונים בהיפוקמפוס העיקריים בצפיפות נמוכה גדלו על coverslips הזכוכית הפוך מעל בשכבת גליה. שכבות הנוירון גליה מופרדות חרוזי פראפין. הנוירונים גדלו על ידי שיטה זו מתאימים הדמיה אופטית מבחנים תפקודיים ברזולוציה גבוהה.

Abstract

היכולת לחקור את המבנה והפיזיולוגיה של תאי עצב בודדים בתרבות חיונית לחקר בנוירוביולוגיה, מקנה גמישות מניפולציה גנטית וכימי של תאים בודדים או רשתות מוגדרות. הקלות של מניפולציה כזו היא פשוטה במערכת התרבות המופחתת בהשוואת רקמת המוח השלמה. בעוד שיטות רבות עבור הבידוד והצמיחה של הנוירונים העיקריים האלה קיימות, לכל אחד מהם יש מגבלות משלה. פרוטוקול זה מתאר שיטה culturing נוירונים בהיפוקמפוס עובריים בצפיפות נמוכה גבוהה טוהר מכרסם על coverslips זכוכית, אשר מושעים אז מעל בשכבה של תאי גליה. זו "תרבות הכריך" מאפשרת לצמיחה ארוך טווח בלעדי של אוכלוסייה של נוירונים ובה בעת לאפשר תמיכה טרופית מן בשכבת גליה הבסיסית. כאשר הנוירונים הם גילו מספיק או לרמת בשלות, את coverslips נוירון ניתן ודפוק של מנת גליה ו המשמש להדמיה או מבחנים תפקודיים. נוירונים grown בשיטה זו בדרך כלל לשרוד במשך כמה שבועות ולפתח סוכות נרחבות, קשרים סינפטיים, ואת מאפייני רשת.

Introduction

המוח מאורגן רשתות מורכבות של נוירונים. תרומתו של נוירונים בודדים לפעילות הרשת תפקוד המוח יכול להיחקר על ידי שינוי סלקטיבית של ההרכב המולקולרי שלהם perturbance של המאפיינים הפיזיולוגיים שלהם. מניפולציה גנטית וכימית של נוירונים בודדים היא ללא ספק קל יותר ב נוירונים בתרבית מאשר רקמת מוח שלמה, משוחרר על ידי ההטרוגניות המורכבות הסלולר של האחרונים. נוירונים בתרבית לפתח אקסונלית מוגדרת היטב סוכות דנדריטים וליצור קשרים סינפטיים נרחבים עם שני.

בעוד נוירון תרבות מחיות מבוגרות או מאזורים אחרים של מערכת העצבים אפשרית, תרבויות בהיפוקמפוס עובריות הם העדיפו לעתים קרובות בשל אוכלוסיית תאי פירמידליים המוגדרת שלהם וצפיפות גליה נמוכה יחסית 1, 2. נוירונים בהיפוקמפוס גדל בצפיפות נמוכה בתרבות במיוחד AMENable ללימוד לוקליזציה subcellular, סחר חלבון, קוטביות עצבית ופיתוח סינפסה. נוירונים בתרבית גם הועסק נרחב בלימוד תהליכים מולקולריים הפלסטיות הסינפטית 3, 4, 5, 6. הכנות תרבות Neuron מעכברים עם מחיקות גנטיות עולמיות כי אינו שורד לאחר לידה כבר שימושיות במיוחד בלימוד התפקידים הסלולר סינפטיים של גנים מסוימים 7.

כמו במוח, נוירונים בהיפוקמפוס תרבותיים תלויים תמיכה טרופית מתא גליה. זה מסבך את התרבות שלהם, והוא הוביל את הפיתוח של מספר שיטות שונות שבאמצעותם תמיכה זו מסופקת. אחת שיטות נפוצות כרוכות ציפוי נוירונים ישירות על בשכבה של תאי גליה 8, או המאפשר ותאי גלייה מזהמים מן Hipp רכשהרקמת ocampal להתרבות וליצור בשכבה מתחת נוירונים 9. אמנם שיטה זו מצאה כמה הצלחה, הטומאה של התרבות העצבית וכתוצאה היא נחה עבור ניסויי הדמיה. שיטה נפוצה נוספת של תרבות נוירון היא לעזוב-אאוט המזין גליה שכבה לגמרי, ובמקום לספק תמיכה טרופית בצורת מדיום גידול מוגדר 10.

כאן, אנו מתארים את "כריך" או "בנקר" השיטה של נוירון תרבות 2, 11. שיטה זו כרוכה ציפוי נוירונים בהיפוקמפוס על coverslips זכוכית, אשר מושעים אז מעל בשכבה של תאי גליה מופרדים חרוזי פראפין. זה מקל על תרבות ארוכת טווח של אוכלוסייה הומוגנית של נוירונים מבלי לזהם גליה ובה בעת לאפשר תמיכה טרופית מן בשכבת גליה הבסיסית. כאשר הנוירונים הם גילו מספיק או רמת בגרות,ניתן והדפוק את coverslips נוירון של מנת גליה ו המשמש להדמיה או מבחנים תפקודיים.

Protocol

כל הניסויים ופרוטוקולים באמצעות חיות מעבדה אושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים מאוניברסיטת מניטובה היו תואמת את ההנחיות של המועצה הקנדית על טיפול בבעלי חיים. 1. הכנת מכשירים, חוצצים ופתרונות <li style=";text-ali…

Representative Results

בשיטת "כריך" זו תרבות תא העצב העיקרית, נוירונים בהיפוקמפוס (איור 3) לגדול על מצע של תאי גליה (איור 1) מופרדות חרוזי פרפין (איור 2). הדבר מבטיח כי נוירונים לגדול באופן סלקטיבי על coverslips זכוכית עם זיהום תא גלייה מינימאלי אבל …

Discussion

בעוד השיטה "כריך" של נוירונים culturing כבר היטב תיאר במקום 2, 11, ישנם מספר צעדים בכל פרוטוקול כי הם די קשה לתאר בצורה של טקסט בלבד, מה שעלול להוביל לתסכול עבור חוקרים המבקשים לאמץ אותו.

השיטה ניתן לח…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי MOP-142,209 CIHR כדי TJS.

Materials

Dissection Instruments
Micro Dissecting Scissors Roboz RS-5910
Micro Dissecting Spring Scissors Roboz RS-5650
Micro Dissecting Spring Scissors Roboz RS-5605
Dumont Forceps (#5) Roboz RS-5045
Dumont Forceps (#PP) Roboz RS-4950
Name Company Catalog Number Comments
Tissue Preparation
Trypsin (2.5%) Gibco 15-090-046
Trypsin-EDTA (0.25%) Gibco 25-200-072
Swinnex Filter Holder, 25 mm EMD Millipore SX0002500 Used as cell strainer. Assemble first with filter and autoclave
Isoflorane Pharmaceutical Partners of Canada Inc. CP0406V2
Hemocytometer Hausser Scientific 1492
Grade 105 Lens Cleaning Tissue GE Healthcare 2105-841 Used as cell strainer. Assemble first in filter holder and autoclave
Glass Pasteur pipettes with cotton filter VWR 14672-412
HEPES (1 M) Gibco 15-630-080
Hank's Balanced Salt Solution without Calcium, Magnesium, Phenol Red (HBSS, 10x) Gibco 14-185-052
Glass Pasteur pipettes VWR 14672-380
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (Dnase) Sigma-Aldrich DN25-100mg
Butane bunsen burner Wall-Lenk Mfg. Co. Model 65
Centrifuge Eppendorf 5810R
Name Company Catalog Number Comments
Tissue Culture
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15-140-122
Petri Dish (100 mm) Fisher FB0875712
Petri Dish (60 mm) Fisher FB0875713A
Horse Serum Gibco 16050-122 Can be used in place of BGS, but each lot must be tested due to inter-lot variation. Heat-inactivation of serum is recommended.  
Sodium Hydroxide Fisher Scientific S318-1
Sodium Pyruvate Sigma-Aldrich P2256
Minimum Essential Medium (MEM) Gibco 11-095-080
Neurobasal Medium Gibco 21-103-049
L-Glutamine (200 mM) Gibco 25-030-081
GlutaMAX Supplement Gibco 35050061 Can be used in place of L-Glutamine in the NBG medium
Culture Dish (60 mm) Corning, Inc 353002
Culture Flasks (75 cm^2) Greiner Bio-One 658170
Cytarabine (Ara-C) Sigma-Aldrich C3350000
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270
Bovine Growth Serum (BGS) HyClone SH3054103 Heat-inactivation is recommended before use.
B27 Supplement (50x) Gibco 17-504-044
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418-100ml
Cryogenic Vials VWR 89094-806
DL-2-Amino-5-phosphonopentanoic acid (APV) Sigma-Aldrich A5282
Name Company Catalog Number Comments
Coverslip Preparation
Sodium tetraborate decahydrate (borax) Sigma-Aldrich B9876-1KG
Poly-L-Lysine Hydrobromide Sigma-Aldrich P2636
Histoplast Paraffin Wax Fisher 22-900-700
Gravity Convection Oven VWR 89511-404 Used for alternative coverslip cleaning method discussed in protocol
Ultrasonic Bath (Sonicator) Fisher Scientific 15337400
Nitric Acid Anachemia 62786-460
Ceramic Staining Racks Thomas Scientific 8542E40 Used for alternative coverslip cleaning method discussed in protocol
Coverslips Glaswarenfabrik Karl Hecht GmbH 1001/18 Manufacturer is very important, as neurons do not adhere well to lower quality glass 
Boric Acid Sigma-Aldrich B0252
Name Company Catalog Number Comments
Miscellaneous
Sterile Syringe Filters VWR 28145-477 Used with BD syringe for filter-sterilization
Syringe  BD 302832 Used with VWR sterile syringe filters for fliter-sterilization
Water Bath Fisher Scientific 15-460-16Q
Inverted Microscope Olympus CKX41
15 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes ThermoScientific 339650
50 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes ThermoScientific 339652

References

  1. Banker, G. A., Cowan, W. M. Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain Res. 126, 397-425 (1977).
  2. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
  3. Adamantidis, A., et al. Optogenetics: 10 years after ChR2 in neurons–views from the community. Nat Neurosci. 18, 1202-1212 (2015).
  4. Ho, V. M., Lee, J. A., Martin, K. C. The cell biology of synaptic plasticity. Science. 334, 623-628 (2011).
  5. Huganir, R. L., Nicoll, R. A. AMPARs and synaptic plasticity: the last 25 years. Neuron. 80, 704-717 (2013).
  6. Luscher, C., et al. Role of AMPA receptor cycling in synaptic transmission and plasticity. Neuron. 24, 649-658 (1999).
  7. Varoqueaux, F., et al. Neuroligins determine synapse maturation and function. Neuron. 51, 741-754 (2006).
  8. Huettner, J. E., Baughman, R. W. Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats. J Neurosci. 6, 3044-3060 (1986).
  9. Lester, R. A., Quarum, M. L., Parker, J. D., Weber, E., Jahr, C. E. Interaction of 6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione with the N-methyl-D-aspartate receptor-associated glycine binding site. Mol Pharmacol. 35, 565-570 (1989).
  10. Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35, 567-576 (1993).
  11. Goslin, K., Asmussen, H., Banker, G., Banker, G., Goslin, K. Rat hippocampal neurons in low-density culture. Culturing nerve cells. 2, 339-370 (1998).
  12. Hanisch, U. K. Microglia as a source and target of cytokines. Glia. 40, 140-155 (2002).

Play Video

Cite This Article
Roppongi, R. T., Champagne-Jorgensen, K. P., Siddiqui, T. J. Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture. J. Vis. Exp. (122), e55000, doi:10.3791/55000 (2017).

View Video