本文介绍用于培养低密度初级海马神经元上倒置在神经胶质单层玻璃盖玻片生长的协议。神经元和神经胶质层通过石蜡珠分离。通过该方法生长的神经元适合于高分辨率光学成像和功能测定法。
探测单个神经细胞的培养物中的结构和生理的能力对于神经生物学的研究是至关重要的,并且允许在单个细胞或定义的网络的遗传和化学操作灵活性。相比于完整的脑组织时操纵这样便于在减少培养系统简单。尽管存在这些初级神经元的分离和生长方法很多,每个人都有其自身的局限性。这个协议描述了一种用于在玻璃盖玻片上,然后将其悬浮在神经胶质细胞的单层培养低密度和高纯度的啮齿动物胚胎海马神经元的方法。这种“三明治文化”允许同时允许从底层的神经胶质单层营养支持的神经元群的独家长期增长。当神经元是足够的年龄或到期水平的,神经元盖玻片可翻转时的胶质菜和在成像或功能测定法中使用。神经元摹rown通过该方法通常存活数周和发展广泛的乔木,突触连接,以及网络属性。
大脑分为神经元的复杂网络。单个神经元到网络活动和脑功能的贡献可以通过它们的分子组成和它们的生理特性的扰动的选择性改变进行研究。单个神经元的遗传和化学处理是在培养的神经元比完整的脑组织受到后者的细胞的异质性和复杂性可以说是容易,无牵无挂。在培养神经细胞发展良好定义的轴突和树突乔木和彼此形成广泛的突触连接。
而来自成年动物或来自神经系统的其他区域神经元培养物是可能的,胚胎海马培养物经常由于优选为所定义的锥体细胞群体和相对低的密度胶质1,2。在培养低密度生长的海马神经元是特别AMEnable到亚细胞定位,蛋白质运输,神经元极性和突触发育的研究。在培养神经细胞也在突触可塑性3,4,5,6研究分子过程被广泛使用。从与不出生后存活的全球基因缺失的小鼠神经元文化的准备工作已经在研究某些基因7的细胞和突触的角色特别有用。
由于在脑,海马神经元依赖于从神经胶质细胞营养支持。这他们的文化复杂化,并导致由这种支持提供几种不同的方法的发展。一种常用的方法包括直接电镀到神经元的神经胶质细胞8,或允许从所获取的HIPP污染物神经胶质细胞的单层ocampal组织增殖并形成神经元9下方的单层。虽然这种方法已经发现了一些成功,得到的神经元培养物中的杂质是不利的成像实验。神经元培养物的另一种常用的方法是将离开时的胶质饲养层完全,而是提供在限定的生长培养基10的形式营养支持。
在这里,我们描述了“三明治”或神经元培养2,11的“银行家”的方法。此方法涉及镀覆在玻璃盖玻片上,然后将其悬浮在由石蜡珠分离的神经胶质细胞的单层的海马神经元。这有利于神经细胞的同质群体的长期培养,而不会污染的神经胶质细胞,同时允许从底层的神经胶质单层营养支持。当神经元是足够的年龄和成熟程度的,神经元盖玻片可翻转时的胶质菜和在成像或功能测定法中使用。
虽然培养神经元的“夹心层”的方法已在别处良好描述2, 如图11所示 ,在整个协议的几个步骤是相当困难的独自描述的文字,这可能会导致沮丧谁希望采纳调查。
该方法可分为三大工作流程:神经胶质培养,盖玻片制备和神经元培养物和维护。这三个准备的是高品质的神经元培养和几个重要的关键因素,必须牢记。电镀神经元前?…
The authors have nothing to disclose.
这项工作是由CIHR MOP-142209到TJS支持。
Dissection Instruments | |||
Micro Dissecting Scissors | Roboz | RS-5910 | |
Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz | RS-5650 | |
Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz | RS-5605 | |
Dumont Forceps (#5) | Roboz | RS-5045 | |
Dumont Forceps (#PP) | Roboz | RS-4950 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Tissue Preparation | |||
Trypsin (2.5%) | Gibco | 15-090-046 | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25-200-072 | |
Swinnex Filter Holder, 25 mm | EMD Millipore | SX0002500 | Used as cell strainer. Assemble first with filter and autoclave |
Isoflorane | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | CP0406V2 | |
Hemocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
Grade 105 Lens Cleaning Tissue | GE Healthcare | 2105-841 | Used as cell strainer. Assemble first in filter holder and autoclave |
Glass Pasteur pipettes with cotton filter | VWR | 14672-412 | |
HEPES (1 M) | Gibco | 15-630-080 | |
Hank's Balanced Salt Solution without Calcium, Magnesium, Phenol Red (HBSS, 10x) | Gibco | 14-185-052 | |
Glass Pasteur pipettes | VWR | 14672-380 | |
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (Dnase) | Sigma-Aldrich | DN25-100mg | |
Butane bunsen burner | Wall-Lenk Mfg. Co. | Model 65 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Tissue Culture | |||
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15-140-122 | |
Petri Dish (100 mm) | Fisher | FB0875712 | |
Petri Dish (60 mm) | Fisher | FB0875713A | |
Horse Serum | Gibco | 16050-122 | Can be used in place of BGS, but each lot must be tested due to inter-lot variation. Heat-inactivation of serum is recommended. |
Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-1 | |
Sodium Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
Minimum Essential Medium (MEM) | Gibco | 11-095-080 | |
Neurobasal Medium | Gibco | 21-103-049 | |
L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25-030-081 | |
GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | Can be used in place of L-Glutamine in the NBG medium |
Culture Dish (60 mm) | Corning, Inc | 353002 | |
Culture Flasks (75 cm^2) | Greiner Bio-One | 658170 | |
Cytarabine (Ara-C) | Sigma-Aldrich | C3350000 | |
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
Bovine Growth Serum (BGS) | HyClone | SH3054103 | Heat-inactivation is recommended before use. |
B27 Supplement (50x) | Gibco | 17-504-044 | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418-100ml | |
Cryogenic Vials | VWR | 89094-806 | |
DL-2-Amino-5-phosphonopentanoic acid (APV) | Sigma-Aldrich | A5282 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Coverslip Preparation | |||
Sodium tetraborate decahydrate (borax) | Sigma-Aldrich | B9876-1KG | |
Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P2636 | |
Histoplast Paraffin Wax | Fisher | 22-900-700 | |
Gravity Convection Oven | VWR | 89511-404 | Used for alternative coverslip cleaning method discussed in protocol |
Ultrasonic Bath (Sonicator) | Fisher Scientific | 15337400 | |
Nitric Acid | Anachemia | 62786-460 | |
Ceramic Staining Racks | Thomas Scientific | 8542E40 | Used for alternative coverslip cleaning method discussed in protocol |
Coverslips | Glaswarenfabrik Karl Hecht GmbH | 1001/18 | Manufacturer is very important, as neurons do not adhere well to lower quality glass |
Boric Acid | Sigma-Aldrich | B0252 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Miscellaneous | |||
Sterile Syringe Filters | VWR | 28145-477 | Used with BD syringe for filter-sterilization |
Syringe | BD | 302832 | Used with VWR sterile syringe filters for fliter-sterilization |
Water Bath | Fisher Scientific | 15-460-16Q | |
Inverted Microscope | Olympus | CKX41 | |
15 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes | ThermoScientific | 339650 | |
50 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes | ThermoScientific | 339652 |