La identificación fiable de las neuronas dopaminérgicas de estar en el mesencéfalo culturas utilizando ARN-Secuenciación y promotor impulsado TH expresión de EGFP
Summary
En la enfermedad de Parkinson (EP), Sustancia negra (SNC) se degeneran las neuronas dopaminérgicas, que conduce a la disfunción motora. Aquí se presenta un protocolo para el cultivo de las neuronas del cerebro medio ventral de un ratón expresan EGFP impulsada por una secuencia promotora tirosina hidroxilasa (TH), cosechando las neuronas fluorescentes individuales de los cultivos, y la medición de su transcriptoma utilizando ARN-ss.
Abstract
En la enfermedad de Parkinson (PD) hay una pérdida neuronal generalizado en todo el cerebro con la degeneración de las neuronas dopaminérgicas pronunciada en la SNC, que conduce a bradicinesia, rigidez y temblor. La identificación de la vida neuronas dopaminérgicas en cultivos primarios ventral mesencefálico (VM) usando un marcador fluorescente proporciona una forma alternativa para estudiar la vulnerabilidad selectiva de estas neuronas sin depender del inmunotinción de células fijadas. En este sentido, aislar, disociar, y la cultura neuronas de ratón VM durante 3 semanas. A continuación, identificar las neuronas dopaminérgicas en los cultivos utilizando eGFP fluorescencia (dirigido por un promotor tirosina hidroxilasa (TH)). Las neuronas individuales se recogen en tubos de microcentrífuga utilizando micropipetas de vidrio. A continuación, se lisan las células recogidas, y llevamos a cabo la síntesis de ADNc y "tagmentation" transposón mediada para producir bibliotecas de ARN-Seq sola celda 1, 2,culo = "xref"> 3, 4, 5. Después de pasar una revisión de control de calidad, las bibliotecas de unicelulares son secuenciados y posterior análisis se lleva a cabo para medir la expresión génica. Presentamos los resultados del transcriptoma para dopaminérgica individual y neuronas GABAérgicas en cultivos de mesencéfalo. Nos informan de que el 100% de las células TH-EGFP en vivo que fueron cosechados y secuenciados eran neuronas dopaminérgicas. Estas técnicas tienen amplias aplicaciones en la neurociencia y la biología molecular.
Introduction
La enfermedad de Parkinson (PD) es un trastorno neurodegenerativo incurable, relacionada con la edad. La causa de este trastorno relativamente común sigue siendo poco conocida. Hay una pérdida generalizada neuronal en todo el cerebro, con la degeneración neuronal pronunciada de las neuronas dopaminérgicas en la Substantia Nigra (SNC), que conduce a las características clínicas de diagnóstico de la bradicinesia, rigidez y temblor.
cultivos mixtos primarios que contienen las neuronas dopaminérgicas SNc son especialmente relevantes para la enfermedad de Parkinson. Área tegmental ventral (VTA) neuronas dopaminérgicas se han implicado en la recompensa y la adicción. Ventral mesencefálico (VM) primarias embrionarios culturas mixtas contienen tanto las neuronas dopaminérgicas Snc y VTA (DA) y las neuronas GABAérgicas. VM cultivos primarios pueden ser útiles para los ensayos de neuroprotección y para dilucidar la vulnerabilidad selectiva de las neuronas dopaminérgicas. No hay manera confiable para identificar las células dopaminérgicas en cultivo basándose en la morfología. Élre desarrollamos técnicas para identificar y cosechar las neuronas dopaminérgicas individuales, y construir una sola célula, bibliotecas de secuenciación de ARN de alto rendimiento.
Presentamos los datos de ARN del transcriptoma representativos de una sola neuronas dopaminérgicas y GABAérgicas en cultivos de mesencéfalo. Este protocolo se puede utilizar para la neuroprotección, neurodegeneración, y los ensayos farmacológicos para estudiar los efectos de diversos tratamientos sobre el transcriptoma DA / GABA. Debido a que las neuronas dopaminérgicas representan una pequeña minoría de las neuronas expresadas en cultivos primarios de VM, la capacidad de identificar de forma fiable estas neuronas en cultivos vivos permitirá una gama mejorada de los estudios de una sola célula. Estas nuevas técnicas facilitarán los avances en la comprensión de los mecanismos que tienen lugar a nivel celular y pueden tener aplicaciones en los campos de la neurociencia y la biología molecular en otro lugar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí aislamos células individuales a partir de una población heterogénea utilizando una etiqueta fluorescente, a continuación, estudiar cada celda con una sola célula de ARN-ss. Nos informan de que el 100% de las células TH-EGFP en vivo que cosecharon y se secuenció eran neuronas dopaminérgicas de hecho, en base a la presencia de los siguientes tres transcripciones de genes relacionados con el DA, TH, DDC y SLC6A3. Todas las células TH-EGFP positivas expresaron estos tres genes según la evaluación de RNA-Seq…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants from the U.S. National Institutes of Health (DA017279, AG033954, DA037743), the Michael J. Fox Foundation, and the Caltech Innovation Initiative funding the Millard and Muriel Jacobs Genetics and Genomics Laboratory at the California Institute of Technology. We thank Brian Williams for optimising the RNA-Seq library protocol and for providing assistance. We thank Henry Amrhein for computational training. We thank Barbara J. Wold for the use of her equipment and laboratory space. We thank Igor Antoshechkin for library sequencing, and for facility management.
Materials
| Papain | Worthington Biochemical Corporation | LS003126 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS), 1X | Gibco | 14175-095 | |
| Donor Equine Serum | Thermo Scientific | SH30074.03 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030-50G | |
| Medium: Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Culture media that contains a stabilized form of L-glutamine, L-alanyl-L-glutamine: GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 0.5 mM final concentration. |
| L-Ascorbic acid | Sigma | A7506 | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | 50 X stock solution, 1 X final concentration. |
| 35 mm glass bottom dishes | MatTek | P35GC-1.5-10-C | |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P4957 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | Stored at -20°C in 20 µL aliquots |
| Deoxyribonuclease I (DNase) | Sigma | DN25 | |
| Blue pipette tips | Sorenson Bioscience, | Inc. 10130 | |
| P1000 | |||
| 10 mm shallow Petri dish | VWR | 25384-324 | |
| 37°C Water bath | |||
| 37°C, 5% humidity incubator | |||
| 16% paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ML | |
| Donkey serum | Equitech | SD-0100HI | 100% stock solution, 1% final concentration. |
| Standard Pattern surgical scissors | Fine Science Tools | 14000-14 | |
| Forceps – 2×3 teeth | Fine Science Tools | 11022-14 | |
| Forceps – Dumont #55 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Forceps – Dumont #5 | Fine Science Tools | 11252-23 | |
| 10X PBS, pH 7.4 | Gibco | 70011-044 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered solution (DPBS) 1X | Gibco | 14190-144 | 500 ml |
| 21 guage needle | BD PrecisionGlide Needle | 305167 | 100 needles |
| Micropipette puller | Sutter Instrument. | model P-87 | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-285 | |
| Sequencing Kit: SMARTer Ultra Low RNA Kit for Illumina Sequencing | Clontech | 634936 | 100rnxs,incl Advantage2PCR Kit |
| oligonucleotide (12 µM): SMARTer IIA oligonucleotide (12 µM) | From the SMARTer Kit | ||
| Reverse transcriptase (100 units) | SMARTcribe reverse transcriptase | From the SMARTer Kit | |
| Primer 1 | 3’ CDSIIa primer | From the SMARTer Kit | |
| Primer 2 | IS PCR primer | From the SMARTer Kit | |
| 50X 2 polymerase mix | 50X Advantage 2 polymerase mix | From the SMARTer Kit | |
| 10X PCR buffer | 10X Advantage 2 PCR buffer | From the SMARTer Kit | |
| RNA Spikes | ThermoFisher | 4456740 | |
| PCR cooler rack | IsoFreeze PCR cooler rack. | ||
| DNA Sample Preparation Kit | (Illumina/Nextera) Nexter | FC-121-1030 | 24 Samples |
| PCR master mix | Nextera PCR master mix (NPM) | From the Nextera Kit | |
| PCR primer cocktail (PPC) | Nextera PCR primer cocktail (PPC) | From the Nextera Kit | |
| Fluorometer | The Qubit ThermoFisher | Q33216 | |
| HS DNA BioAnalyzer kit | Agilent | 5067-4626 | 110rxns |
| Electrophoresis system | Agilent 2100 Bioanalyzer. | G2938C | |
| Magnetic beads: Agencourt AMPure | Beckman Coulter | A63880 | 5ml |
| RNAse wipe: RNAse Zap wipes | Ambion | AM9786 | Size 100 Sheets |
| Qubit ds HS Assay Kit | Molecular probes | Q32854 | 500 assays |
| Gel extraction kit: Qiaquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| Glass capillary tubing | (Kimax-51, 1.5–1.8 mm o.d.) | ||
| Microforge | Narishige (or equivalent) | ||
| Sequencer | Illumina HiSeq instrument | ||
| GENSAT tyrosine hydroxylase-eGFP mouse strain | MMRRC stock number: 000292-UNC | Stock Tg(Th-EGFP)DJ76Gsat/Mutant Mouse Regional Research Center |
References
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