تحديد موثوق المعيشة الدوبامين الخلايا العصبية في الدماغ المتوسط الثقافات عن طريق RNA تسلسل وTH يحركها المروج EGFP التعبير
Summary
في مرض باركنسون (PD)، المادة السوداء (SNC) الخلايا العصبية الدوبامين تتحول، مما يؤدي إلى خلل وظيفي السيارات. نحن هنا نورد بروتوكول لزراعة الخلايا العصبية الدماغ المتوسط بطني من ماوس معربا عن EGFP يقودها تسلسل المروج هيدروكسيلاز التيروزين (TH)، حصاد الخلايا العصبية الفلورسنت الفردية من الثقافات، وقياس Transcriptome على الخاصة بهم باستخدام الحمض النووي الريبي يليها.
Abstract
في مرض باركنسون (PD) هناك فقدان الخلايا العصبية على نطاق واسع في جميع أنحاء الدماغ مع انحطاط وضوحا من الخلايا العصبية الدوبامين في المجلس الوطني السوري، مما يؤدي إلى بطء الحركة، وصلابة، والزلزال. تحديد يعيشون الخلايا العصبية الدوبامين في الثقافات الأولية بطني الدماغ المتوسط (VM) باستخدام علامة فلوري يوفر وسيلة بديلة لدراسة الضعف الانتقائي لهذه الخلايا العصبية دون الاعتماد على المناعية للخلايا ثابتة. هنا، نحن عزل، فصل، والثقافة الماوس VM الخلايا العصبية لمدة 3 أسابيع. ثم نحدد الخلايا العصبية الدوبامين في الثقافات باستخدام EGFP مضان (يقودها المروج هيدروكسيلاز التيروزين (TH)). ويتم حصاد الخلايا العصبية الفردية في أنابيب microcentrifuge باستخدام بال micropipettes الزجاج. المقبل، ونحن ليز الخلايا تحصد، وإجراء توليف [كدنا وبوساطة ينقول "tagmentation" لإنتاج خلية واحدة-RNA يليها مكتبات 1، 2،الحمار = "XREF"> 3، 4، 5. بعد اجتياز فحص لمراقبة الجودة، والتسلسل المكتبات وحيدة الخلية ويتم تحليلها لاحقا إلى قياس التعبير الجيني. نفيدكم النتائج Transcriptome على لالدوبامين الفردية والخلايا العصبية GABAergic معزولة عن الثقافات الدماغ المتوسط. نفيدكم أن 100٪ من خلايا TH-EGFP الحية التي تم حصادها والتسلسل كانت الخلايا العصبية الدوبامين. وهذه التقنيات لها تطبيقات واسعة في علم الأعصاب وعلم الأحياء الجزيئي.
Introduction
مرض باركنسون (PD) هو، اضطراب الاعصاب عضال المرتبطة بالعمر. سبب هذا الاضطراب شائع نسبيا لا تزال غير مفهومة. هناك خسارة واسعة النطاق العصبية في جميع أنحاء الدماغ، مع انحطاط الخلايا العصبية وضوحا من الخلايا العصبية الدوبامين في المادة السوداء (SNC)، مما يؤدي إلى مظاهر سريرية التشخيص من بطء الحركة والجمود والهزة.
الثقافات المختلطة الابتدائية التي تحتوي على SNC الخلايا العصبية الدوبامين هي ذات الصلة وخاصة لمرض الشلل الرعاش. قد تورطت بطني السقيفية المنطقة (VTA) الخلايا العصبية الدوبامين في الثواب والإدمان. بطني الدماغ المتوسط (VM) الابتدائية الثقافات الجنينية مختلطة تحتوي على كل SNC وVTA الدوبامين (DA) الخلايا العصبية والخلايا العصبية GABAergic. يمكن VM الثقافات الأولية أن تكون مفيدة لفحوصات العصبية ولإلقاء الضوء على ضعف انتقائي من الخلايا العصبية الدوبامين. لا توجد وسيلة يمكن الاعتماد عليها لتحديد الخلايا الدوبامين في ثقافة تقوم على التشكل. هوإعادة نطور تقنيات لتحديد وحصاد الخلايا العصبية الدوبامين واحدة، وبناء وحيدة الخلية، وارتفاع العائد المكتبات RNA التسلسل.
نحن إبلاغ بيانات الحمض النووي الريبي Transcriptome على تمثيلية للالدوبامين واحد والخلايا العصبية GABAergic معزولة عن الثقافات الدماغ المتوسط. هذا البروتوكول يمكن استخدامها لالعصبية، التنكس العصبي، والمقايسات الدوائية لدراسة آثار العلاجات المختلفة على Transcriptome على DA / GABA. لأن الخلايا العصبية الدوبامين تمثل أقلية صغيرة من الخلايا العصبية التي أعرب عنها في الثقافات VM الأولية، فإن القدرة على تحديد موثوق هذه الخلايا العصبية في الثقافات التي تعيش تمكين مجموعة محسنة من الدراسات وحيدة الخلية. وهذه التقنيات الجديدة تسهيل التقدم في فهم الآليات التي تجري على المستوى الخلوي، ويمكن أن تكون لها تطبيقات في أماكن أخرى في مجالات علم الأعصاب وعلم الأحياء الجزيئي.
Protocol
Representative Results
Discussion
نحن هنا عزل الخلايا واحد من السكان غير متجانسة باستخدام علامة فلوري، ثم دراسة كل خلية مع وحيدة الخلية RNA وما يليها. نفيدكم أن 100٪ من خلايا TH-EGFP حية أننا حصادها والتسلسل كانت الخلايا العصبية الدوبامين في الواقع، على أساس وجود ثلاث نسخ الجينات المرتبطة DA التالية، TH، DDC وs…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants from the U.S. National Institutes of Health (DA017279, AG033954, DA037743), the Michael J. Fox Foundation, and the Caltech Innovation Initiative funding the Millard and Muriel Jacobs Genetics and Genomics Laboratory at the California Institute of Technology. We thank Brian Williams for optimising the RNA-Seq library protocol and for providing assistance. We thank Henry Amrhein for computational training. We thank Barbara J. Wold for the use of her equipment and laboratory space. We thank Igor Antoshechkin for library sequencing, and for facility management.
Materials
| Papain | Worthington Biochemical Corporation | LS003126 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS), 1X | Gibco | 14175-095 | |
| Donor Equine Serum | Thermo Scientific | SH30074.03 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030-50G | |
| Medium: Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Culture media that contains a stabilized form of L-glutamine, L-alanyl-L-glutamine: GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 0.5 mM final concentration. |
| L-Ascorbic acid | Sigma | A7506 | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | 50 X stock solution, 1 X final concentration. |
| 35 mm glass bottom dishes | MatTek | P35GC-1.5-10-C | |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P4957 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | Stored at -20°C in 20 µL aliquots |
| Deoxyribonuclease I (DNase) | Sigma | DN25 | |
| Blue pipette tips | Sorenson Bioscience, | Inc. 10130 | |
| P1000 | |||
| 10 mm shallow Petri dish | VWR | 25384-324 | |
| 37°C Water bath | |||
| 37°C, 5% humidity incubator | |||
| 16% paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ML | |
| Donkey serum | Equitech | SD-0100HI | 100% stock solution, 1% final concentration. |
| Standard Pattern surgical scissors | Fine Science Tools | 14000-14 | |
| Forceps – 2×3 teeth | Fine Science Tools | 11022-14 | |
| Forceps – Dumont #55 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Forceps – Dumont #5 | Fine Science Tools | 11252-23 | |
| 10X PBS, pH 7.4 | Gibco | 70011-044 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered solution (DPBS) 1X | Gibco | 14190-144 | 500 ml |
| 21 guage needle | BD PrecisionGlide Needle | 305167 | 100 needles |
| Micropipette puller | Sutter Instrument. | model P-87 | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-285 | |
| Sequencing Kit: SMARTer Ultra Low RNA Kit for Illumina Sequencing | Clontech | 634936 | 100rnxs,incl Advantage2PCR Kit |
| oligonucleotide (12 µM): SMARTer IIA oligonucleotide (12 µM) | From the SMARTer Kit | ||
| Reverse transcriptase (100 units) | SMARTcribe reverse transcriptase | From the SMARTer Kit | |
| Primer 1 | 3’ CDSIIa primer | From the SMARTer Kit | |
| Primer 2 | IS PCR primer | From the SMARTer Kit | |
| 50X 2 polymerase mix | 50X Advantage 2 polymerase mix | From the SMARTer Kit | |
| 10X PCR buffer | 10X Advantage 2 PCR buffer | From the SMARTer Kit | |
| RNA Spikes | ThermoFisher | 4456740 | |
| PCR cooler rack | IsoFreeze PCR cooler rack. | ||
| DNA Sample Preparation Kit | (Illumina/Nextera) Nexter | FC-121-1030 | 24 Samples |
| PCR master mix | Nextera PCR master mix (NPM) | From the Nextera Kit | |
| PCR primer cocktail (PPC) | Nextera PCR primer cocktail (PPC) | From the Nextera Kit | |
| Fluorometer | The Qubit ThermoFisher | Q33216 | |
| HS DNA BioAnalyzer kit | Agilent | 5067-4626 | 110rxns |
| Electrophoresis system | Agilent 2100 Bioanalyzer. | G2938C | |
| Magnetic beads: Agencourt AMPure | Beckman Coulter | A63880 | 5ml |
| RNAse wipe: RNAse Zap wipes | Ambion | AM9786 | Size 100 Sheets |
| Qubit ds HS Assay Kit | Molecular probes | Q32854 | 500 assays |
| Gel extraction kit: Qiaquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| Glass capillary tubing | (Kimax-51, 1.5–1.8 mm o.d.) | ||
| Microforge | Narishige (or equivalent) | ||
| Sequencer | Illumina HiSeq instrument | ||
| GENSAT tyrosine hydroxylase-eGFP mouse strain | MMRRC stock number: 000292-UNC | Stock Tg(Th-EGFP)DJ76Gsat/Mutant Mouse Regional Research Center |
References
- Henley, B. M., et al. Transcriptional regulation by nicotine in dopaminergic neurons. Biochem Pharmacol. 86 (8), 1074-1083 (2013).
- Marinov, G. K., et al. From single-cell to cell-pool transcriptomes: stochasticity in gene expression and RNA splicing. Genome Res. 24 (3), 496-510 (2014).
- Kim, D. H., et al. Single-cell transcriptome analysis reveals dynamic changes in lncRNA expression during reprogramming. Cell Stem Cell. 16 (1), 88-101 (2015).
- Ramskold, D., et al. Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells. Nat Biotechnol. 30 (8), 777-782 (2012).
- Gertz, J., et al. Transposase mediated construction of RNA-seq libraries. Genome Res. 22 (1), 134-141 (2012).
- Morris, J., Singh, J. M., Eberwine, J. H. Transcriptome analysis of single cells. J Vis Exp. (50), (2011).
- Trapnell, C., et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nat Protoc. , 562-578 (2012).
- Srinivasan, R., et al. Smoking-Relevant Nicotine Concentration Attenuates the Unfolded Protein Response in Dopaminergic Neurons. The Journal of Neuroscience. 36 (1), 65-79 (2016).
- Henderson, B. J., et al. Menthol Alone Upregulates Midbrain nAChRs, Alters nAChR Subtype Stoichiometry, Alters Dopamine Neuron Firing Frequency, and Prevents Nicotine Reward. J Neurosci. 36 (10), 2957-2974 (2016).
- Gong, S., et al. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425 (6961), 917-925 (2003).
- Kim, J., Henley, B. M., Kim, C. H., Lester, H. A., Yang, C. Incubator embedded cell culture imaging system (EmSight) based on Fourier ptychographic microscopy. Biomed Opt Express. (8), 3097-3110 (2016).
- Lammel, S., et al. Diversity of transgenic mouse models for selective targeting of midbrain dopamine neurons. Neuron. 85 (2), 429-438 (2015).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
- Dryanovski, D. I., et al. Calcium entry and alpha-synuclein inclusions elevate dendritic mitochondrial oxidant stress in dopaminergic neurons. J Neurosci. 33 (24), 10154-10164 (2013).
- Kimm, T., Khaliq, Z. M., Bean, B. P. Differential Regulation of Action Potential Shape and Burst-Frequency Firing by BK and Kv2 Channels in Substantia Nigra Dopaminergic Neurons. J Neurosci. 35 (50), 16404-16417 (2015).
