Zuverlässige Identifikation von Wohn dopaminerge Neurone in Mittelhirns Kulturen unter Verwendung von RNA-Sequenzierung und TH-Promotor getriebene eGFP Expression
Summary
Bei der Parkinson-Krankheit (PD), Substantia Nigra (SNC) dopaminergen Neuronen degenerieren, was zu Motorstörungen. Hier berichten wir über ein Protokoll zur Kultivierung von ventralen Mittelhirns Neuronen aus einer Maus eGFP durch eine Tyrosinhydroxylase (TH) Promotorsequenz angetrieben exprimieren, Ernten einzelnen fluoreszierenden Neuronen aus den Kulturen, und die Messung ihrer Transkriptom RNA-seq verwenden.
Abstract
Bei der Parkinson-Krankheit (PD) ist weit verbreitet Verlust von Neuronen im Gehirn mit ausgeprägter Degeneration dopaminerger Neurone in der SNc, was zu Bradykinesie, Rigidität und Tremor. Die Identifizierung von lebenden dopaminergen Neuronen in der primären ventrale mesencephalen (VM) Kulturen einen fluoreszierenden Marker bietet eine alternative Möglichkeit die selektive Anfälligkeit dieser Neuronen, ohne sich auf die Immunfärbung von fixierten Zellen zu studieren. Hier isolieren wir distanzieren und Kultur Maus VM Neuronen für 3 Wochen. Wir identifizieren dann dopaminergen Neuronen in den Kulturen mit eGFP-Fluoreszenz (angetrieben von einem Tyrosin-Hydroxylase (TH) Promotor). Einzelne Neuronen werden in Mikrozentrifugenröhrchen unter Verwendung von Glasmikropipetten geerntet. Als nächstes wir die geernteten Zellen lysieren und cDNA – Synthese und Transposon-vermittelte "tagmentation" leiten einzelne Zelle RNA-Seq – Bibliotheken 1, 2, zu erzeugen ,ass = "xref"> 3, 4, 5. Nach dem Passieren wird eine Qualitätskontrollprüfung werden Einzelzellen-Bibliotheken sequenziert und die anschließende Analyse durchgeführt Genexpression zu messen. Wir berichten Transkriptom Ergebnisse für einzelne dopaminergen und GABA-erge Neuronen aus Mittelhirns Kulturen isoliert. Wir berichten, dass 100% der lebenden TH-eGFP-Zellen, die geerntet wurden und sequenziert wurden dopaminergen Neuronen. Diese Techniken haben weit verbreitete Anwendungen in der Neurowissenschaft und Molekularbiologie.
Introduction
Parkinson-Krankheit (PD) ist eine unheilbare, altersbedingte neurodegenerative Erkrankung. Die Ursache für diese relativ häufige Erkrankung bleibt kaum verstanden. Es ist weit verbreitet Neuronenverlust im gesamten Gehirn, mit ausgeprägter neuronaler Degeneration von dopaminergen Neuronen in der Substantia nigra (SNC), was zu einem diagnostischen klinischen Merkmale der Bradykinesie, Rigor und Tremor.
Primäre Mischkulturen SNc dopaminergen Neuronen enthalten, sind besonders relevant für die Parkinson-Krankheit. Ventralen Tegmentum (VTA) dopaminergen Neuronen wurden in Lohn und Sucht beteiligt. Ventrale mesencephalen (VM) primären gemischten embryonalen Kulturen enthalten sowohl SNc und VTA dopaminergen (DA) Neuronen und GABAergen Neuronen. VM Primärkulturen können für Neuroprotektion Assays nützlich sein und die selektive Anfälligkeit von dopaminergen Neuronen aufzuklären. Es gibt keine zuverlässige Möglichkeit, dopaminergen Zellen in Kultur, die auf Morphologie zu identifizieren. ErSingle-Cell, High-Yield-RNA-Sequenzierung Bibliotheken re entwickeln wir Techniken einzelne dopaminergen Neuronen zu identifizieren und zu ernten, und zu konstruieren.
Wir berichten Vertreter RNA Transkriptom-Daten für einzelne dopaminergen und GABA-erge Neuronen aus Mittelhirns Kulturen isoliert. Dieses Protokoll kann für Neuroprotektion, Neurodegeneration und pharmakologische Tests verwendet werden, um die Wirkungen von verschiedenen Behandlungen auf dem DA / GABA Transkriptom zu studieren. Da dopaminergen Neuronen eine kleine Minderheit der exprimierten Neuronen in der primären VM Kulturen repräsentieren, die Fähigkeit, zuverlässig diese Neuronen in lebenden Kulturen identifizieren eine erweiterte Palette von Single-Cell-Studien ermöglichen. Diese neuen Techniken werden Fortschritte erleichtern, die Mechanismen zu verstehen, Platz auf der zellulären Ebene und Anwendungen an anderer Stelle in den Bereichen der Neurowissenschaften und Molekularbiologie haben.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier isolieren wir einzelne Zellen aus einer heterogenen Population einen Fluoreszenzmarker verwenden, dann jede Zelle studieren mit Single-Cell-RNA-seq. Wir berichten, dass 100% der lebenden TH-eGFP-Zellen, die wir waren tatsächlich dopaminergen Neuronen geerntet und sequenziert, basierend auf der Anwesenheit der folgenden drei DA-verwandtes Gen-Transkripte, TH, DDC und SLC6A3. Alle der TH-eGFP positiven Zellen, die diese drei Gene exprimiert durch RNA-Seq beurteilt wie. Das war konkordant mit elektrophysiologischen S…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants from the U.S. National Institutes of Health (DA017279, AG033954, DA037743), the Michael J. Fox Foundation, and the Caltech Innovation Initiative funding the Millard and Muriel Jacobs Genetics and Genomics Laboratory at the California Institute of Technology. We thank Brian Williams for optimising the RNA-Seq library protocol and for providing assistance. We thank Henry Amrhein for computational training. We thank Barbara J. Wold for the use of her equipment and laboratory space. We thank Igor Antoshechkin for library sequencing, and for facility management.
Materials
| Papain | Worthington Biochemical Corporation | LS003126 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS), 1X | Gibco | 14175-095 | |
| Donor Equine Serum | Thermo Scientific | SH30074.03 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030-50G | |
| Medium: Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Culture media that contains a stabilized form of L-glutamine, L-alanyl-L-glutamine: GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 0.5 mM final concentration. |
| L-Ascorbic acid | Sigma | A7506 | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | 50 X stock solution, 1 X final concentration. |
| 35 mm glass bottom dishes | MatTek | P35GC-1.5-10-C | |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P4957 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | Stored at -20°C in 20 µL aliquots |
| Deoxyribonuclease I (DNase) | Sigma | DN25 | |
| Blue pipette tips | Sorenson Bioscience, | Inc. 10130 | |
| P1000 | |||
| 10 mm shallow Petri dish | VWR | 25384-324 | |
| 37°C Water bath | |||
| 37°C, 5% humidity incubator | |||
| 16% paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ML | |
| Donkey serum | Equitech | SD-0100HI | 100% stock solution, 1% final concentration. |
| Standard Pattern surgical scissors | Fine Science Tools | 14000-14 | |
| Forceps – 2×3 teeth | Fine Science Tools | 11022-14 | |
| Forceps – Dumont #55 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Forceps – Dumont #5 | Fine Science Tools | 11252-23 | |
| 10X PBS, pH 7.4 | Gibco | 70011-044 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered solution (DPBS) 1X | Gibco | 14190-144 | 500 ml |
| 21 guage needle | BD PrecisionGlide Needle | 305167 | 100 needles |
| Micropipette puller | Sutter Instrument. | model P-87 | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-285 | |
| Sequencing Kit: SMARTer Ultra Low RNA Kit for Illumina Sequencing | Clontech | 634936 | 100rnxs,incl Advantage2PCR Kit |
| oligonucleotide (12 µM): SMARTer IIA oligonucleotide (12 µM) | From the SMARTer Kit | ||
| Reverse transcriptase (100 units) | SMARTcribe reverse transcriptase | From the SMARTer Kit | |
| Primer 1 | 3’ CDSIIa primer | From the SMARTer Kit | |
| Primer 2 | IS PCR primer | From the SMARTer Kit | |
| 50X 2 polymerase mix | 50X Advantage 2 polymerase mix | From the SMARTer Kit | |
| 10X PCR buffer | 10X Advantage 2 PCR buffer | From the SMARTer Kit | |
| RNA Spikes | ThermoFisher | 4456740 | |
| PCR cooler rack | IsoFreeze PCR cooler rack. | ||
| DNA Sample Preparation Kit | (Illumina/Nextera) Nexter | FC-121-1030 | 24 Samples |
| PCR master mix | Nextera PCR master mix (NPM) | From the Nextera Kit | |
| PCR primer cocktail (PPC) | Nextera PCR primer cocktail (PPC) | From the Nextera Kit | |
| Fluorometer | The Qubit ThermoFisher | Q33216 | |
| HS DNA BioAnalyzer kit | Agilent | 5067-4626 | 110rxns |
| Electrophoresis system | Agilent 2100 Bioanalyzer. | G2938C | |
| Magnetic beads: Agencourt AMPure | Beckman Coulter | A63880 | 5ml |
| RNAse wipe: RNAse Zap wipes | Ambion | AM9786 | Size 100 Sheets |
| Qubit ds HS Assay Kit | Molecular probes | Q32854 | 500 assays |
| Gel extraction kit: Qiaquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| Glass capillary tubing | (Kimax-51, 1.5–1.8 mm o.d.) | ||
| Microforge | Narishige (or equivalent) | ||
| Sequencer | Illumina HiSeq instrument | ||
| GENSAT tyrosine hydroxylase-eGFP mouse strain | MMRRC stock number: 000292-UNC | Stock Tg(Th-EGFP)DJ76Gsat/Mutant Mouse Regional Research Center |
References
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