זיהוי אמין של חיים דופאמין נוירונים תרבויות המוח התיכון באמצעות רצף RNA ו- TH-מונחה האמרגן ביטוי eGFP
Summary
במחלת פרקינסון (PD), חומר שחור (SNC) נוירונים דופאמינרגיים להתנוון, שמובילים מוטורי. כאן אנו מדווחים פרוטוקול נוירונים culturing מוח תיכון גחון של עכבר להביע eGFP מונע על ידי hydroxylase טירוזין (TH) רצף אמרגן, קצירת נוירונים ניאון פרט מן התרבויות, ומדידת transcriptome שלהם באמצעות-seq RNA.
Abstract
במחלת פרקינסון (PD) יש איבוד עצבי נפוץ בכל רחבי המוח עם ניוון בולט של נוירונים דופאמינרגיים ב SNC, שמוביל bradykinesia, קשיחות, ורעד. זיהוי של נוירונים דופאמינרגיים המתגוררים mesencephalic הגחון עיקרי (VM) תרבויות באמצעות סמן פלואורסצנטי מספק דרך חלופית לחקור את הפגיעות סלקטיבי של נוירונים אלה ללא הסתמכות על immunostaining של תאים קבועים. כאן, אנו לבודדים, לנתק, ועכבר תרבות נוירונים VM למשך 3 שבועות. לאחר מכן, אנו לזהות נוירונים דופאמינרגיים בתרבויות באמצעות קרינת eGFP (מונעת על ידי אמרגן טירוזין hydroxylase (TH)). נוירונים בודדים נקצרים לתוך צינורות microcentrifuge באמצעות micropipettes זכוכית. בשלב הבא, אנחנו lyse התאים שנקטפו, ולערוך סינתזה cDNA ו בתיווך transposon "tagmentation" לייצר ספריות RNA-seq תא בודד 1, 2,התחת = "Xref"> 3, 4, 5. אחרי שעברה המחאה בקרת איכות, ספריות תא בודד הם רצף וניתוח שלאחר מכן מתבצעת כדי למדוד ביטוי גנים. אנו מדווחים על תוצאות transcriptome עבור דופאמין הפרט נוירונים GABAergic מבודד מתרבויות המוח התיכון. אנו מדווחים כי 100% של תאי TH-eGFP החיים שנמסקו להפיק ולרצף היו נוירונים דופאמינרגיים. טכניקות אלו יהיו יישומים נפוצים במדעי המוח וביולוגיה מולקולרית.
Introduction
מחלת פרקינסון (PD) היא הפרעת ניווניות חשוכות מרפא, כתוצאה מהזדקנות. סיבת הפרעה שכיחה יחסית זה נשאר הבינה היטב. יש איבוד עצבי נפוצה בכל רחבי המוח, עם ניוון עצבי מובהק של נוירונים דופאמינרגיים ב nigra substantia (SNC), מה שמוביל מאפיינים קליניים אבחון של bradykinesia, קשיחות ורעד.
תרבויות מעורבות ראשיות המכילות נוירונים דופאמינרגיים SNC שרלוונטיות ספציפי לטיפול במחלת הפרקינסון. פינת הגחון tegmental (VTA) נוירונים דופאמינרגיים היו מעורבים גמול והתמכרות. הגחון mesencephalic (VM) עיקרי תרבויות עובריות מעורבות מכילות הוא SNC ו דופאמין VTA (DA) נוירונים נוירונים GABAergic. תרבויות העיקריות VM יכולות להיות שימושיות עבור מבחני neuroprotection וכדי להבהיר את הפגיעות סלקטיבי של נוירונים דופאמינרגיים. אין דרך אמינה לזהות תאים דופאמינרגיים בתרבות המבוסס על מורפולוגיה. הואמחדש אנו מפתחים טכניקות לזהות ולאסוף נוירונים דופאמינרגיים יחידים, ולבנות ספריות רצף RNA חד-תאית, תשואה גבוהה.
אנו מדווחים נתוני transcriptome RNA נציג דופאמין יחיד נוירונים GABAergic מבודדים מתרבויות מוח תיכונות. פרוטוקול זה יכול לשמש neuroprotection, ניוון מוחיה, מבחנים תרופתיים כדי לחקור את ההשפעות של טיפולים שונים על transcriptome DA / GABA. בגלל נוירונים דופאמינרגיים מייצגים מיעוט קטן של נוירונים הביע בתרבויות VM עיקריות, את היכולת לזהות נוירונים באופן מהימן אלה בתרבויות חיים תאפשר מגוון משופר של מחקרי תא בודד. טכניקות רומן אלה תקלנה התקדמות בהבנת המנגנונים המתרחשים ברמת התא ייתכן יישומים במקום אחר בתחומי הנוירולוגיה ביולוגיה מולקולרית.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן אנו לבודד תאים בודדים מתוך אוכלוסייה הטרוגנית באמצעות תג פלורסנט, אז ללמוד כל תא עם-seq רנ"א חד-תאי. אנו מדווחים כי 100% של תאי TH-eGFP החיים מסקנו להפיק ולרצף היו אכן נוירונים דופאמינרגיים, מבוססים על הנוכחות של תמלילי גן DA הבאים קשור שלוש, TH, DDC ו slc6a3. כל התא החיובי TH-eGFP …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants from the U.S. National Institutes of Health (DA017279, AG033954, DA037743), the Michael J. Fox Foundation, and the Caltech Innovation Initiative funding the Millard and Muriel Jacobs Genetics and Genomics Laboratory at the California Institute of Technology. We thank Brian Williams for optimising the RNA-Seq library protocol and for providing assistance. We thank Henry Amrhein for computational training. We thank Barbara J. Wold for the use of her equipment and laboratory space. We thank Igor Antoshechkin for library sequencing, and for facility management.
Materials
| Papain | Worthington Biochemical Corporation | LS003126 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS), 1X | Gibco | 14175-095 | |
| Donor Equine Serum | Thermo Scientific | SH30074.03 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030-50G | |
| Medium: Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Culture media that contains a stabilized form of L-glutamine, L-alanyl-L-glutamine: GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 0.5 mM final concentration. |
| L-Ascorbic acid | Sigma | A7506 | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | 50 X stock solution, 1 X final concentration. |
| 35 mm glass bottom dishes | MatTek | P35GC-1.5-10-C | |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P4957 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | Stored at -20°C in 20 µL aliquots |
| Deoxyribonuclease I (DNase) | Sigma | DN25 | |
| Blue pipette tips | Sorenson Bioscience, | Inc. 10130 | |
| P1000 | |||
| 10 mm shallow Petri dish | VWR | 25384-324 | |
| 37°C Water bath | |||
| 37°C, 5% humidity incubator | |||
| 16% paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ML | |
| Donkey serum | Equitech | SD-0100HI | 100% stock solution, 1% final concentration. |
| Standard Pattern surgical scissors | Fine Science Tools | 14000-14 | |
| Forceps – 2×3 teeth | Fine Science Tools | 11022-14 | |
| Forceps – Dumont #55 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Forceps – Dumont #5 | Fine Science Tools | 11252-23 | |
| 10X PBS, pH 7.4 | Gibco | 70011-044 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered solution (DPBS) 1X | Gibco | 14190-144 | 500 ml |
| 21 guage needle | BD PrecisionGlide Needle | 305167 | 100 needles |
| Micropipette puller | Sutter Instrument. | model P-87 | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-285 | |
| Sequencing Kit: SMARTer Ultra Low RNA Kit for Illumina Sequencing | Clontech | 634936 | 100rnxs,incl Advantage2PCR Kit |
| oligonucleotide (12 µM): SMARTer IIA oligonucleotide (12 µM) | From the SMARTer Kit | ||
| Reverse transcriptase (100 units) | SMARTcribe reverse transcriptase | From the SMARTer Kit | |
| Primer 1 | 3’ CDSIIa primer | From the SMARTer Kit | |
| Primer 2 | IS PCR primer | From the SMARTer Kit | |
| 50X 2 polymerase mix | 50X Advantage 2 polymerase mix | From the SMARTer Kit | |
| 10X PCR buffer | 10X Advantage 2 PCR buffer | From the SMARTer Kit | |
| RNA Spikes | ThermoFisher | 4456740 | |
| PCR cooler rack | IsoFreeze PCR cooler rack. | ||
| DNA Sample Preparation Kit | (Illumina/Nextera) Nexter | FC-121-1030 | 24 Samples |
| PCR master mix | Nextera PCR master mix (NPM) | From the Nextera Kit | |
| PCR primer cocktail (PPC) | Nextera PCR primer cocktail (PPC) | From the Nextera Kit | |
| Fluorometer | The Qubit ThermoFisher | Q33216 | |
| HS DNA BioAnalyzer kit | Agilent | 5067-4626 | 110rxns |
| Electrophoresis system | Agilent 2100 Bioanalyzer. | G2938C | |
| Magnetic beads: Agencourt AMPure | Beckman Coulter | A63880 | 5ml |
| RNAse wipe: RNAse Zap wipes | Ambion | AM9786 | Size 100 Sheets |
| Qubit ds HS Assay Kit | Molecular probes | Q32854 | 500 assays |
| Gel extraction kit: Qiaquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| Glass capillary tubing | (Kimax-51, 1.5–1.8 mm o.d.) | ||
| Microforge | Narishige (or equivalent) | ||
| Sequencer | Illumina HiSeq instrument | ||
| GENSAT tyrosine hydroxylase-eGFP mouse strain | MMRRC stock number: 000292-UNC | Stock Tg(Th-EGFP)DJ76Gsat/Mutant Mouse Regional Research Center |
References
- Henley, B. M., et al. Transcriptional regulation by nicotine in dopaminergic neurons. Biochem Pharmacol. 86 (8), 1074-1083 (2013).
- Marinov, G. K., et al. From single-cell to cell-pool transcriptomes: stochasticity in gene expression and RNA splicing. Genome Res. 24 (3), 496-510 (2014).
- Kim, D. H., et al. Single-cell transcriptome analysis reveals dynamic changes in lncRNA expression during reprogramming. Cell Stem Cell. 16 (1), 88-101 (2015).
- Ramskold, D., et al. Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells. Nat Biotechnol. 30 (8), 777-782 (2012).
- Gertz, J., et al. Transposase mediated construction of RNA-seq libraries. Genome Res. 22 (1), 134-141 (2012).
- Morris, J., Singh, J. M., Eberwine, J. H. Transcriptome analysis of single cells. J Vis Exp. (50), (2011).
- Trapnell, C., et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nat Protoc. , 562-578 (2012).
- Srinivasan, R., et al. Smoking-Relevant Nicotine Concentration Attenuates the Unfolded Protein Response in Dopaminergic Neurons. The Journal of Neuroscience. 36 (1), 65-79 (2016).
- Henderson, B. J., et al. Menthol Alone Upregulates Midbrain nAChRs, Alters nAChR Subtype Stoichiometry, Alters Dopamine Neuron Firing Frequency, and Prevents Nicotine Reward. J Neurosci. 36 (10), 2957-2974 (2016).
- Gong, S., et al. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425 (6961), 917-925 (2003).
- Kim, J., Henley, B. M., Kim, C. H., Lester, H. A., Yang, C. Incubator embedded cell culture imaging system (EmSight) based on Fourier ptychographic microscopy. Biomed Opt Express. (8), 3097-3110 (2016).
- Lammel, S., et al. Diversity of transgenic mouse models for selective targeting of midbrain dopamine neurons. Neuron. 85 (2), 429-438 (2015).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
- Dryanovski, D. I., et al. Calcium entry and alpha-synuclein inclusions elevate dendritic mitochondrial oxidant stress in dopaminergic neurons. J Neurosci. 33 (24), 10154-10164 (2013).
- Kimm, T., Khaliq, Z. M., Bean, B. P. Differential Regulation of Action Potential Shape and Burst-Frequency Firing by BK and Kv2 Channels in Substantia Nigra Dopaminergic Neurons. J Neurosci. 35 (50), 16404-16417 (2015).
