السريع العصبية تمايز الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات لقياس نشاط الشبكة على المصفوفات الدقيقة الكهربائي
Summary
نحن تعديل وتنفيذ بروتوكول نشرت سابقا تصف التمايز السريع، واستنساخه، وكفاءة الناجمة عن النشاط البشري الخلايا الجذعية المحفزة (hiPSCs) في العصبونات القشرية مثير 12. على وجه التحديد، لدينا التعديل يسمح للسيطرة على كثافة الخلايا العصبية واستخدامها في صفائف الكهربائي الصغير لقياس الخصائص الكهربية على مستوى الشبكة.
Abstract
الخلايا العصبية مشتقة من فعل الإنسان الخلايا الجذعية المحفزة (hiPSCs) توفير أداة جديدة واعدة لدراسة الاضطرابات العصبية. في العقد الماضي، وقد وضعت بروتوكولات عديدة للتمييز hiPSCs إلى الخلايا العصبية. ومع ذلك، فإن هذه البروتوكولات هي غالبا ما تكون بطيئة مع تقلبات عالية، وانخفاض استنساخ، وانخفاض الكفاءة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الخلايا العصبية التي تم الحصول عليها مع هذه البروتوكولات وغالبا ما تكون غير ناضجة وتفتقر إلى النشاط الوظيفي الكافي على الصعيدين حيدة الخلية والشبكة ما لم الخلايا العصبية يتم تربيتها لعدة أشهر. ويرجع ذلك جزئيا إلى هذه القيود، والخصائص الوظيفية للشبكات العصبية مشتقة hiPSC-لا تزال تتميز ليس على ما يرام. هنا، علينا أن نكيف بروتوكول نشر مؤخرا أن يصف إنتاج الخلايا العصبية البشرية من hiPSCs بواسطة التعبير القسري للعامل النسخ neurogenin-2 12. هذا البروتوكول هو السريع (الغلة الخلايا العصبية الناضجة في غضون 3 أسابيع) وكفاءة، مع ما يقرب من 100٪ كفاءة التحويل من transducخلايا إد (> 95٪ من الخلايا دابي الإيجابي هي MAP2 إيجابي). وعلاوة على ذلك، فإن بروتوكول غلة السكان متجانسة من الخلايا العصبية مثير من شأنه أن يسمح التحقيق في الخلية من نوع المساهمات المحددة لاضطرابات عصبية. نحن تعديل البروتوكول الأصلي عن طريق توليد خلايا hiPSC transduced ثابت، مما يتيح لنا التحكم الصريح على العدد الكلي للخلايا العصبية. ثم يتم استخدام هذه الخلايا لتوليد الشبكات العصبية مشتقة hiPSC على صفائف الكهربائي الصغير. في هذه الطريقة، والنشاط الكهربية التلقائي للشبكات العصبية مشتقة hiPSC ويمكن قياسها وتتميز، مع الحفاظ على الاتساق interexperimental من حيث كثافة الخلية. بروتوكول المعروضة ينطبق على نطاق واسع، وخاصة بالنسبة للدراسات الميكانيكية والدوائية على شبكات الخلايا العصبية البشرية.
Introduction
تطوير الناجمة عن النشاط البشري الخلايا الجذعية المحفزة (hiPSCs) بروتوكولات التمايز لتوليد الخلايا العصبية البشرية في المختبر قدمت أداة قوية جديدة لدراسة الاضطرابات العصبية. حتى وقت قريب، وقد أعاق دراسة هذه الاضطرابات بشدة من عدم وجود نظم نموذج باستخدام الخلايا العصبية البشرية. على الرغم من القوارض يمكن استخدامها لدراسة الاضطرابات العصبية، ونتائج مثل هذه الدراسات لا يمكن ترجمتها بسهولة إلى البشر 1. ونظرا لهذه القيود، الخلايا العصبية المستمدة hiPSC-هي نموذج بديل واعد والتي يمكن استخدامها لتوضيح الآليات الجزيئية الكامنة وراء الاضطرابات العصبية وفي المختبر فحص المخدرات.
في العقد الماضي، عدة بروتوكولات لتحويل وضعت hiPSCs إلى الخلايا العصبية 2-8. ومع ذلك، هذه البروتوكولات لا تزال محدودة في نواح كثيرة. أولا، بروتوكولات غالبا ما تستغرق وقتا طويلا: توليد الخلايا العصبية مع النضج الكافي (أي synapتشكيل ذاته) ونشاط وظيفي يتطلب أشهر من إجراءات زراعة، مما يجعل الدراسات على نطاق واسع الصعبة 9. وبالإضافة إلى ذلك، hiPSC إلى الخلايا العصبية كفاءة التحويل منخفضة. بروتوكولات غالبا ما تسفر عن السكان غير متجانسة من الخلايا العصبية، وبالتالي لا تسمح دراسات فرعية معينة من الخلايا العصبية. وعلاوة على ذلك، فإن البروتوكولات ليست قابلة للتكرار، مما أسفر عن نتائج مختلفة لمختلف خطوط التوجيهية 10،11. وأخيرا، فإن مرحلة النضج والخصائص الوظيفية للخلايا العصبية الناتجة أيضا متغيرة 10.
لمعالجة هذه المشاكل، وتشانغ وآخرون. (2013) 12 وضعت البروتوكول الذي يولد بسرعة وبتكاثر الخلايا العصبية البشرية من hiPSCs التي كتبها overexpressing عامل النسخ neurogenin-2. كما ذكرت من قبل المؤلفين، يحدث التمايز بسرعة نسبيا (فقط 2 – بعد 3 أسابيع حمل تعبيرا عن neurogenin-2)، والبروتوكول هو استنساخه (خصائص الخلايا العصبية مستقلة عن الصورةtarting خط hiPSC)، وتحويل hiPSC إلى الخلايا العصبية هو كفاءة عالية (حوالي 100٪). السكان من الخلايا العصبية ولدت مع بروتوكول بهم ومتجانسة (تشبه العليا طبقة الخلايا العصبية القشرية)، مما يتيح للتحقيق في الخلية من نوع مساهمات محددة للاضطرابات العصبية. وعلاوة على ذلك، أظهرت الخلايا العصبية المستمدة hiPSC-خصائص الناضجة (على سبيل المثال، القدرة على تشكيل نقاط الاشتباك العصبي ونشاط وظيفي قوي) بعد د 20 فقط.
وصف الخصائص الكهربية للخلايا العصبية مشتقة hiPSC على مستوى شبكة شرط مسبق هام قبل التكنولوجيا hiPSC يمكن استغلالها لدراسة الأمراض التي تصيب الإنسان. لهذا السبب، وقد بدأت العديد من المجموعات البحثية مؤخرا للتحقيق في الخلايا العصبية المشتقة الخلايا الجذعية على مستوى الشبكة باستخدام مجموعة الكهربائي الصغير (MEA) الأجهزة (النظم المتعددة، ريوتلنجن، ألمانيا) 13-16. هي جزء لا يتجزأ من الأقطاب الكهربائية من الشرق الأوسط وأفريقيا في الركيزة التي الخلايا العصبية يمكن تربيتها.الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف يمكن استخدامها لاستكشاف الخصائص الكهربية للشبكات العصبية والتنمية في المختبر من نشاطها. حاليا، تستخدم الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف فقط في تركيبة مع بروتوكولات التمايز التي تستغرق عدة أشهر لانتاج شبكات ناضجة. وبالتالي، والجمع بين الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف مع بروتوكول التمايز السريع من شأنها أن تسهل استخدام هذه التكنولوجيا في الدراسات على نطاق واسع من الاضطرابات العصبية.
هنا، نقدم تعديل آل تشانغ وآخرون. (2013) 12 البروتوكول وتكييفه للاستخدام على الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف. على وجه الخصوص، بدلا من الاعتماد على تنبيغ lentiviral الحاد، ونحن بدلا من ذلك خلق خطوط hiPSC التعبير عن مستقر rtTA / Ngn2 قبل إحداث التمايز. فعلنا هذا في المقام الأول إلى السيطرة استنساخه على كثافة الخلايا العصبية، حيث أن كثافة الخلايا العصبية هو أمر حاسم لتشكيل شبكة الخلايا العصبية، والاتصال الجيد بين الخلايا العصبية والأقطاب من الشرق الأوسط وأفريقيا 17،18. الثوجح آل تشانغ وآخرون. بروتوكول فعال جدا فيما يتعلق تحويل hiPSCs transduced، فمن متغير بطبيعته فيما يتعلق العائد النهائي من الخلايا العصبية من عدد hiPSCs مطلي في البداية (انظر الشكل 2E في تشانغ وآخرون.) 12. مع خط ثابت، علينا القضاء على العديد من القضايا تسبب تقلبات، مثل سمية lentiviral وكفاءة العدوى. نحن ثم الأمثل المعلمات التي تنتج بشكل موثوق الشبكات العصبية مشتقة hiPSC على الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف، والحصول على نضوج شبكة (على سبيل المثال، أحداث متزامنة بين أغلبية من القنوات) في الأسبوع الثالث. هذا البروتوكول السريع والموثوق به هذا يجب تمكين مقارنات مباشرة بين الخلايا العصبية المستمدة من مختلف خطوط hiPSC (أي المريض محددة)، وكذلك توفير الاتساق القوي للدراسات الدوائية.
Protocol
Representative Results
Discussion
نحن هنا قمنا بتنفيذ كفاءة بروتوكول hiPSC تمايز نشرتها تشانغ وآخرون. (2013) (12) لقياس النشاط شبكة من الشبكات العصبية مشتقة hiPSC على الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف. نحن تكييفها البروتوكول الأصلي عن طريق إنشاء rtTA / Ngn2 خط hiPSC -positive قبل إحداث تمايز الخلايا العصبية. هذه خطوة إضافية تتيح لنا التحكم في كثافة الخلايا العصبية في الشرق الأوسط وأفريقيا. والسيطرة على كثافة الخلايا العصبية شرطا مسبقا هاما للتكيف مع البروتوكول إلى الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف وضمان الاتساق. لقياس نشاط الشبكات العصبية باستخدام الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف، وتحتاج الخلايا العصبية لتشكيل شبكات كثيفة مباشرة على الجزء العلوي من أقطاب الشرق الأوسط وأفريقيا 17،18. وهذا يتطلب بالضرورة رقابة مشددة على كثافة الطلاء من الخلايا العصبية. وrtTA / Ngn2 خط hiPSC -positive يسمح للسيطرة على كثافة الخلايا العصبية لأن هذا التكتيك لا تعتمد على transductions lentiviral الحادة من hiPSCs قبل التمايز.وبالتالي ما يقرب من rtTA / Ngn2 خط hiPSC -positive يزيل أي تغيير في العائد النهائي بسبب، على سبيل المثال، سمية lentiviral وكفاءة عدوى متغيرة.
خطوة أخرى معارضة للإجراء التجريبي هو عدد الخلايا النجمية الفئران التي cocultured مع hiPSCs التفريق. الخلايا النجمية تسهم بفعالية في صقل تطوير الدوائر العصبية عن طريق التحكم في تشكيل المشبك، والصيانة، والقضاء، وكلها عمليات مهمة للعمل الخلايا العصبية. بروتوكول المعروضة في هذه الورقة هو غاية نجمية تعتمد: حتى يكتمل نضجها وتشكيل نقاط الاشتباك العصبي وظيفية، تتطلب الخلايا العصبية بدعم من الخلايا النجمية. عانينا من أن عدد الخلايا النجمية يجب أن تكون مساوية تقريبا لعدد من الخلايا العصبية المستمدة hiPSC لدعم نضوج الخلايا العصبية وتشكيل شبكات العصبية واظهار النشاط العفوي. منذ لدينا نجمية عوائد بروتوكول طريق مسدود خلية الأساسيتوريس مع عمر محدود، وعزل الخلايا النجمية الفئران لابد من تنفيذها بانتظام.
لدينا التكيف البروتوكول الذي نشرته تشانغ وآخرون. (2013) 12 للاستخدام مع التكنولوجيا الشرق الأوسط وأفريقيا من المرجح أن تحسن إلى حد كبير قدرتنا على دراسة النشاط شبكة من شبكات المستمدة hiPSC. سابقا، البروتوكولات المستخدمة لدراسة الشبكات العصبية مشتقة hiPSC مع الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف تعتمد على إجراءات المفاضلة تستغرق وقتا طويلا 13-16. البروتوكول من تشانغ وآخرون. (2013) توفر بديلا سريعا، ولدينا تعديل يزيل مصدرا للتقلب، مما يجعله الآن أكثر جدوى استخدام الخلايا العصبية المستمدة hiPSC في تركيبة مع التكنولوجيا الشرق الأوسط وأفريقيا، وخاصة في الإنتاجية العالية أو الدراسات الدوائية. وبالإضافة إلى ذلك، لأن طريقة التي نشرتها تشانغ وآخرون. (2013) 12 تعطي السكان متجانسة من الطبقة العليا العصبونات القشرية، لدينا بروتوكول تكييفها يجعل دراسات مركزة الممكنة في الشبكةctivity هذا فرعية العصبية معينة.
ومع ذلك، فإن هذا النهج له أيضا العديد من القيود. أولا، تجانس الثقافات يمكن أيضا اعتبار وضع غير مؤات، لأن الثقافات هم أقل عرضة للتشبه في الشبكات الجسم الحي، حيث فئات مختلفة من الخلايا العصبية (أي الخلايا العصبية المثبطة ومثير) تشكل شبكة غير المتجانسة. لمزيد من تعزيز استخدام الخلايا العصبية المستمدة hiPSC مع التكنولوجيا الشرق الأوسط وأفريقيا، سيكون من المهم وضع بروتوكولات التمايز (القائم على التحوير) السريع لغيرهم من السكان الخلايا العصبية. إذا أصبحت البروتوكولات المتاحة، فإن في المختبر شبكات تحاكي في الجسم الحي الشبكات بشكل وثيق. ثانيا، في الخلايا النجمية الفئران الحالية يجب أن تضاف إلى الخلايا العصبية المستمدة hiPSC لدعم النمو، وبالتالي فإن الشبكة العصبية الناتجة ليس الإنسان العصبية شبكة بالمعنى الضيق. بروتوكولات يمكن الاعتماد عليها للتمييز hiPSCs إلى الخلايا النجمية يجوز في سول في المستقبلهاء هذه المشكلة 26. ثالثا، الشبكات العصبية ثنائية الأبعاد، كما هو موضح هنا، هي نموذج محدود لدراسة ثلاثية الأبعاد في الجسم الحي الشبكات العصبية المعقدة. لحسن الحظ، والبروتوكولات واصفا الثقافات ثلاثية الأبعاد من الخلايا العصبية الأولية الفئران في تركيبة مع التكنولوجيا MEA متاحة بالفعل 27،28. مستقبلي، يجب الجمع بين البروتوكولات التمايز السريعة للحصول على الخلايا العصبية والخلايا النجمية المستمدة hiPSC مع تقنيات زراعة ثلاثية الأبعاد وتكنولوجيا MEA تعطي نظرة جديدة إلى الآليات البيولوجية الكامنة وراء الاضطرابات العصبية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Jessica Classen for performing the whole-cell patch-clamp experiments. The hiPSCs used in our experiments were kindly provided by Huiqing Zhou and Willem van den Akker from the Radboud University Nijmegen. The transfer vectors used in this protocol were kindly provided by Oliver Brüstle, Philipp Koch and Julia Ladewig from the University of Bonn Medical Centre.
Materials
| Lebovitz's L-15 medium | Gibco | 11415-064 | |
| B-27 supplement | Gibco | 0080085SA | |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | |
| Ca2+/Mg2+-free HBSS | Gibco | 14175-095 | |
| 0.05 % Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| 2.5 % Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| High-glucose DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442-500ML | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| 70 µm cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| DPBS | Gibco | 14190-094 | |
| psPAX2 lentiviral packaging vector | Addgene | Plasmid #12260 | |
| pMD2.G lentiviral packaging vector | Addgene | Plasmid #12259 | |
| Basement membrane matrix | Gibco | A1413201 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-074 | |
| Cell detachment solution | Sigma-Aldrich | A6964 | |
| E8 medium | Gibco | A1517001 | |
| ROCK inhibitor | Gibco | A2644501 | Alternatively, ROCK inhibitors like thiazovivin can be used. |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268-5G | |
| G418 | Sigma-Aldrich | G8168-10ML | |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P9620-10ML | |
| Vitronectin | Gibco | A14700 | |
| 6-well MEAs | Multi Channel Systems | 60-6wellMEA200/30iR-Ti-tcr | |
| Glass coverslips | VWR | 631-0899 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P3655-10MG | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020-1MG | |
| Doxycyclin | Sigma-Aldrich | D9891-5G | |
| N-2 supplement | Gibco | 17502-048 | |
| Non-essential amino acids | Sigma-Aldrich | M7145 | |
| NT-3, human recombinant | Promokine | C66425 | |
| BDNF, human recombinant | Promokine | C66212 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| L-alanyl-L-glutamine | Gibco | 35050-038 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside | Sigma-Aldrich | C1768-100MG | |
| Straight fine-tipped forceps | Fine Science Tools | 11251 | |
| Fine-tipped spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 |
References
- Ahfeldt, T., Litterman, N. K., Rubin, L. Studying human disease using human neurons. Brain Res. , (2016).
- Zhang, S. C., Wernig, M., Duncan, I. D., Brustle, O., Thomson, J. A. In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 19 (12), 1129-1133 (2001).
- Perrier, A. L., et al. Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (34), 12543-12548 (2004).
- Wu, H., et al. Integrative genomic and functional analyses reveal neuronal subtype differentiation bias in human embryonic stem cell lines. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (34), 13821-13826 (2007).
- Chambers, S. M., Fasano, C. A., Papapetrou, E. P., Tomishima, M., Sadelain, M., Studer, L. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27 (3), 275-280 (2009).
- Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nat Protoc. 7, 1836-1846 (2012).
- Espuny-Camacho, I., et al. Pyramidal neurons derived from human pluripotent stem cells integrate efficiently into mouse brain circuits in vivo. Neuron. 77 (3), 440-456 (2013).
- Maroof, A. M., et al. Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12 (5), 559-572 (2013).
- Johnson, M. A., Weick, J. P., Pearce, R. A., Zhang, S. C. Functional neural development from human embryonic stem cells: accelerated synaptic activity via astrocyte coculture. J Neurosci. 27 (12), 3069-3077 (2007).
- Hu, B. Y., et al. Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (9), 4335-4340 (2010).
- Kim, H., et al. miR-371-3 expression predicts neural differentiation propensity in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 8 (6), 695-706 (2011).
- Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
- Odawara, A., Saitoh, Y., Alhebshi, A. H., Gotoh, M., Suzuki, I. Long-term electrophysiological activity and pharmacological response of a human induced pluripotent stem cell-derived neuron and astrocyte co-culture. Biochem Biophys Res Commun. 443 (4), 1176-1181 (2014).
- Odawara, A., Katoh, H., Matsuda, N., Suzuki, I. Physiological maturation and drug responses of human induced pluripotent stem cell-derived cortical neuronal networks in long-term culture. Sci Rep. 6, 26181 (2016).
- Amin, H., Maccione, A., Marinaro, F., Zordan, S., Nieus, T., Berdondini, L. Electrical Responses and Spontaneous Activity of Human iPS-Derived Neuronal Networks Characterized for 3-month Culture with 4096-Electrode Arrays. Front Neurosci. 10, (2016).
- Heikkila, T. J., et al. Human embryonic stem cell-derived neuronal cells form spontaneously active neuronal networks in vitro. Exp Neurol. 218 (1), 109-116 (2009).
- Massobrio, P., Massobrio, G., Martinoia, S. Multi-program approach for simulating recorded extracellular signals generated by neurons coupled to microelectrode arrays. Neurocomputing. 70, 2467-2476 (2007).
- Wang, L., Riss, M., Buitrago, J. O., Claverol-Tinturé, E. Biophysics of microchannel-enabled neuron-electrode interfaces. J Neural Eng. 9 (2), (2012).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85, 890-902 (1980).
- Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. J. Vis. Exp. (71), e50079 (2013).
- Pacifici, M., Peruzzi, F. Isolation and culture of rat embryonic neural cells: a quick protocol. J Vis Exp. (63), e3965 (2012).
- Ba, W., et al. ARHGAP12 functions as a developmental brake on excitatory synapse function. Cell Rep. 14 (6), 1355-1368 (2016).
- Bologna, L. L., et al. Investigating neuronal activity by SPYCODE multi-channel data analyzer. Neural Netw. 23 (6), 685-697 (2010).
- Ba, W., et al. TRIO loss of function is associated with mild intellectual disability and affects dendritic branching and synapse function. Hum Mol Genet. 25 (5), 892-902 (2016).
- Benevento, M., et al. Histone methylation by the Kleefstra syndrome protein EHMT1 mediates homeostatic synaptic scaling. Neuron. 91 (2), 341-355 (2016).
- Krencik, R., Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, Z. -. J., Zhang, S. -. C. Specification of transplantable astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nature biotechnology. 29 (6), 528-534 (2011).
- Frega, M., Tedesco, M., Massobrio, P., Pesce, M., Martinoia, S. Network dynamics of 3D engineered neuronal cultures: a new experimental model for in-vitro electrophysiology. Sci Rep. 4, 5489 (2014).
- Tedesco, M., Frega, M., Martinoia, S., Pesce, M., Massobrio, P. Interfacing 3D engineered neuronal cultures to micro-electrode arrays: an innovative in vitro experimental model. J Vis Exp. (104), e53080 (2015).
