Mikro-elektrot dizileri Ağ Aktivite Ölçüm uyarılmış pluripotent kök hücrelerin Rapid Nöronal Farklılaşma

hayvanlar üzerinde tüm deneyler Hayvan Bakım Komitesi, Radboud Üniversitesi Tıp Merkezi, Hollanda, (: 77.073 RU-Aralık-2011-021, protokol numarası) onaylanmış hayvan bakım ve kullanım talimatlarına uygun olarak gerçekleştirilmiştir. 1. Glia Hücre İzolasyonu ve Kültür NOT: Burada sunulan protokol Velli 19 McCarthy çalışmalarına ve de dayanır ve fare astrositler için bir çok benzer ayrıntılı bir protokol mevcut 20 mesafesindedir. Embriyonik (E18) fare beyinlerinden korteks astrositler birincil kültürleri oluşturmak için, hamile bir sıçan feda edilmesi gerekmektedir, embriyolar rahim hasat edilmesi gerekir ve beyinleri embriyolardan izole edilmesi gerekir. T75 şişeyi doldurmak için, 2 embriyonik beyinlerinden korteks kombine edilmesi gerekir. Bir alternatif olarak, ticari olarak temin edilebilir, saflaştırılmış ve dondurulmuş astrositler satın alınabilir. T75 kültür şişesi hazırlayın Seyreltik poli-D-Lisin (PDL) 'de10 ug / ml bir son konsantrasyona kadar, steril saf su. T75 kültür şişesine seyreltilmiş PDL 5 ml ekleyin. tüm büyüme yüzeyini ıslak etrafında yavaşça swish. 3 saat boyunca nemlendirilmiş 37 ° C inkübatör içine yerleştirilir. şişeden PDL aspire. bağlanmamış PDL kaldırmak için 5 ml steril su ile şişesi 3x durulayın. Tamamen su aspire. bir laminar akış başlığı ya hemen kullanılmıştır kurumaya balon bırakın. Korteks diseksiyonu % 2 (v / v) B-27 ilavesi ile Lebovitz L-15 orta: 50 ml diseksiyon orta hazırlayın. buz üzerinde tutun. (- 8 dak ~ 5) solunum sona erene kadar bir indüksiyon odasında derin izofluran ile sıçan (küçük pleksiglas kutu) anestezisi. indüksiyon odasından sıçan çıkarın ve hemen servikal dislokasyon ötenazi. % 70 EtOH ile sıçan karın sprey ve aşırı silin. Açığa ve Sezaryen secti aracılığıyla baraj rahim kaldırmakmakas 21 bir çift kullanarak. Makasla kendi amnion kesesi bireysel embriyolar kesilmiş soğuk diseksiyon orta ile dolu bir steril Petri kabı transfer ve buz üzerinde tutmak. soğuk diseksiyon ortam ile donatılmış bir steril 6 cm Petri için tekrar embriyolar aktarın. stereo bir mikroskop altında embriyolardan beyinleri ekstrakte edin. beyin ortaya çıkarmak için hafifçe forseps kullanarak deri ve kafatası uzak soyun. Yavaşça tüm beyin kepçe ve taze, soğuk diseksiyon orta ile 35 mm Petri kabı transfer. Not: embriyolarından kesilir Bütün beyinler hücre yaşama yeteneklerini kaybettirmeden, birçok saat buz üzerinde diseksiyon ortamında saklanabilir. ince uçlu yaylı makas veya neşter ile orta hat boyunca keserek her beynin iki yarısının ayırın. Dikkatle düz ince uçlu forseps ile meninks kapalı şerit. NOT: Bu tamamen meninksler kaldırmak için çok önemlidir. thastrosit kültürü engeller fibroblast kirliliğidir. Fibroblastlar hızla bölünen hücreler ve sonunda diğer hücreleri yerinden edecek. orta beyin / striatum ve yaylı makas veya neşter ile koku ampulü çıkarın. Ayrıca yaylı makas veya bir bisturi ile (korteks ile ilgili perimedian ve kaudal C-şekilli bir yapı) hipokampus kaldırmak için emin olun. 5 ml diseksiyon ortam maddesi ile doldurulmuş bir 15 ml santrifüj tüpüne kortikal hemisferlerin toplayın. buz üzerinde tutun. Korteks ayrışma Hazırlama 2 mL Ca2 + / Mg2 + içermeyen% 0.25 tripsin ile Hank'in dengeli tuz çözeltisi (HBSS) (ayrışma ortamı). 50 mL yüksek glukoz,% 15 (h / h) fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 ile Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı (DMEM) (h / h), penisilin / streptomisin (kültür ortamı) ve filtre sterilize hazırlayın. Doku santrifüj tüpünün dibine dinlendiriniz. dikkatledokudan yukarıdan mümkün olduğunca diseksiyon orta kadar korsan. 2+ / Mg 2 + içermeyen HBSS (tripsin olmadan) 5 ml Ca doku yıkayın ve doku tüpün dibinde yerleşmek için izin verir. Dikkatle HBSS aspire. 2 mL ayrıştırma ortamı ekleyin ve doku etrafında enzimi karıştırmak için hafifçe tüp fiske. 5-10 dakika için 37 ° C su banyosu içinde inkübe edin. doku çalkalamak için inkübasyon sırasında tüpü birkaç kez Flick. Hemen 1.000 uL pipet kullanarak doku çiğnemek. yaklaşık 800 mcL pipetter sesini ayarlama. parçaları aspire ve doğrudan sıvı hattı üzerinde, tüp yüzüne zorla çıkarmak. Ancak, kabarcıklar veya köpüklenme en aza indirmeye çalışın. 20x – Doku yeterince yaklaşık 15 ayrışmış kadar tekrarlayın. Tripsin inaktive 8 ml kültür ortamı ekleyin. Tüp hafifçe birkaç kez baş aşağı çevirerek kanştınn. 50 m üstüne yerleştirilmiş bir 70 mikron hücre süzgecinden hücre süspansiyonu geçirinL'lik bir santrifüj tüpü. kültür ortamında 15 ml tüp yıkayın ve hücre süspansiyonu ile 50 ml bir tüp içinde orta toplamak için hücre süzgecinden orta filtre. hücre süzgeç kültür ortamı ile bir kaç kez yıkayın. 25 ml – durulanmasından sonra, son hacmi, yaklaşık 20 olması gerekir. 10 dakika boyunca 200 x g'de Pelet hücreleri. Dikkatle hücre pelletini dokunmadan, mümkün olduğu kadar çok bir ortam aspire edin. 1000 uL pipet kullanılarak 1 mL kültür ortamı içinde tekrar süspansiyon hücreleri. 11 mL önceden ısıtılmış kültür ortamı ekleyin ve 10 ml pipet kullanarak (kabarcıklarını engellemek için) hafifçe karıştırın. 5 ml kültür ortamı ile bir kez PDL kaplı T75 şişesi durulayın. orta aspire ve şişeye hücre süspansiyonu aktarın. Tüm hücreler kaplanır süspansiyonda, ve biz astrositler süspansiyon diğer hücrelerden ayırt edilemez çünkü genellikle gereksiz, onları saymak bulabilirsiniz. % 5 CO2 f atmosferi olan nemlendirilmiş bir 37 ° C inkübatör içine içine yerleştirilirya da iki gün. Genişleme ve astrositler bakımı ilk kaplama sonra ilk kez 2 gün boyunca tüm orta yerine. Tüm orta sonradan her 3 d değiştirin. Her hücrelere ilave edilmeden önce 37 ° C'ye kadar taze ortam prewarm. NOT: astrositler 7 gerektiren – yaklaşık% 90 confluency (astrositler mikroglia ve oligodendrosit üstüne yalan ve karışmış olan bir yoğun paketlenmiş mozaik desenli tek tabaka olarak görünür) ulaşmak için 10 d. astrositler yaklaşık% 90 confluency ulaştığında, kirlenmesine glial hücreleri çıkarmak için şişeyi sallayın: inkübatör şişeyi çıkarın ve kapağı (fenolik) sıkın ya da bağlantı noktasını kapsayacak (süzülmüş). mikroglia kaldırmak için 1 saat 180 rpm'de bir orbital platform üzerinde çalkalanır. orta aspire. 5 ml önceden ısıtılmış bir kültür ortamı, aspirasyon ile bir kez yıkayın ve 12 ml kültür ortamı ile değiştirin. Ayırmakoligodendrosit O / N, tercihen yörünge platforma şişeyi geri 250 rpm'de sallamak 37 ° C, 7 saat en az fakat. orta aspire. 5 ml önceden ısıtılmış bir kültür ortamı, aspirasyon ile bir kez yıkayın ve 12 ml kültür ortamı ile değiştirin. inkübatör şişeyi geri dönün. % 0.05 tripsin etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ile 2: 1 ila 3:% 100 konfluent, 1 oranında, standart prosedürler kullanılarak astrositler split. % 100 confluency A T75 şişesi tipik toplamda yaklaşık 4.0 x 10 6 hücre verecektir. Bu programa göre, kültürler genellikle haftada bir kez bölünebilir. Not: astrositler konfluent ulaştığında, hasat edilebilir ve protokol adım 3.4 aşağıda tarif edildiği gibi hiPSC farklılaşması için de kullanılır. astrositler canlılığı bir fark kaybı olmadan en az bir kez bölünebilir. Bu kültürde, 2 ay boyunca muhafaza edilebilir. deneyim, birincil embriyonik 18 günlük sıçan astrositler progressively terminal farklılaşmış olabilir ve / veya tekrarlanan ayrıldıktan sonra canlılığını kaybeder. ileride kullanılmak üzere astrositler dondurmak mümkün olsa da, biz gerektiğinde taze embriyonik beyinleri gelen astrositler izole tercih. RtTA 2. Üretim / Ngn2 pozitif hiPSCs NOT: yeniden programlama c-myc, Sox2, Oct4 ve Klf4 faktörleri ile deneyler için kullanılan hiPSCs insan fibroblast lentiviral transdüksiyon tarafından in-house üretilmiştir. Not: rtTA / Ngn2 -pozitif hiPSCs oluşturulması için, lentiviral vektörler stabil olarak hiPSCs genomu transgenlerin entegre etmek için kullanılır. Lentivirüs üretimi için protokol daha önce 22 yayınlanmıştır. RtTA ve Ngn2 lentivirüs parçacıkları üretmek için kullanılan lentiviral ambalaj vektörlerinin bilgilerini temin edilmiştir <strong> Malzeme / Ekipman Masa. RtTA lentivirüs için kullanılan transfer vektörü pLVX-EF1α- olduğu (Tet-On-İleri) -IRES-G418 (R); örneğin, bu vektör, antibiyotik G418 için bir kurucu EF1α promotörün kontrolü altında Gelişmiş transaktivatör Tet-On ve kazandıran direnç kodlar. Ngn2 lentivirüs için kullanılan transfer vektör pLVX- (TRE-thight) – (FARE) Ngn2-PGK-Puromycin (R); örneğin, bu vektör, murin Neurogenin-2 Tet kontrollü promoterinin kontrolü ve bir kurucu PGK promoterinin kontrolü altında puromisin direnç geni altında geni kodlar. Bu nedenle, bu iki transfer vektörleri kullanılarak bir hiPSC hattı oluşturulabilir olan murin Neurogenin-2 ifadesi doksisiklin ile orta ilave tarafından indüklenebilir. HiPSCs transdüksiyonu için, lentivirüs partikülleri içeren süpernatan kullanılır, örneğin, zeka (metnin geri kalan kısmında "lentivirüs süspansiyon" olarak adlandırılır)hout ultrasantrifüj kullanılarak parçacıklar konsantre edildi. HiPSCs Plate (gün 1) NOT: Bu protokol açıklanan miktarlar hiPSCs 6 gözenekli bir plakada kültürlenmiştir olduğu ve bir kuyunun hücreler hasat varsayalım. Buna ek olarak, hücreler, bir 12 yuvalı plaka 12 kuyu sonradan kaplanır varsayılmıştır. Seyreltilmiş BMM elde edilmesi için,% 1 (h / h) Bazal Membran Matrisi (BMM) 10 ml soğuk DMEM / F12 hazırlayın. 12 çukurlu bir levhanın her çukuruna BMM seyreltilmiş 800 uL ekleyin. % 5 CO2 atmosferi olan nemlendirilmiş bir 37 ° C kuluçka makinesi içinde en az 1 saat süreyle inkübe edin. Kullanmadan önce, oda sıcaklığında 1 saat için plaka inkübe edin. % 1 (h / h), penisilin / streptomisin, 9 ml DMEM / F12 ve oda sıcaklığına kadar 1 ml hücre kopması çözeltisi (CDS) Sıcak 15 mL uçucu 8 (E8) ortamı. Rho-ilişkili protein kinaz (ROCK) inhibitörü ile E8 orta tamamlar. hiPSCs harcanan orta aspire birD hiPSCs 1 ml CDS ekleyin. % 5 CO2 atmosferi olan nemlendirilmiş bir 37 ° C kuluçka makinesi içinde 5 dakika – 3 inkübe edin. Hücreler birbirlerinden ayrılmakta olup olmadığını mikroskop altında kontrol edin. nazikçe 1.000 uL pipet ile hücreleri askıya ve 15 ml tüp hücreleri aktarmak, kuyuda 2 ml DMEM / F12 ekleyin. Hücre süspansiyonuna 7 ml DMEM / F12 ekleyin. 5 dakika boyunca 200 xg'de hücreleri dönerler. Süpernatantı aspire ve hazırlanan E8 orta 2 mL ekleyin. hiPSCs 15 ml tüpün kenarına 1000 uL pipet ucu koyarak ve yavaşça yeniden süspansiyona alınmasıyla (hücre kümeleri oluşturmaz) ayrışmış olduğu bir hücre süspansiyonu elde edilir. Hücreler ayrışmış olup olmadığını mikroskop altında kontrol edin. Bir hemositometre odasını kullanan hücreler (hücre / ml) sayısını belirler. NOT: 80 de A 6 kuyu plaka – toplam 4,0 x 10 6 hücre -% 90 confluency tipik 3.0 verecektir. soluklu12 gözlü bir levhanın gözleri arasında BMM seyreltilmiştir. 3.0 x 10 4 hücre / mL'lik bir hücre süspansiyonu elde etmek için hücreleri seyreltilir. 12 gözlü plakanın her bir kuyucuğu hücre süspansiyonu Levha 1 ml. % 5 CO2 atmosferi olan nemlendirilmiş bir 37 ° C kuluçka makinesi içinde 12 oyuklu plaka O / N yerleştirin. RtTA ve Ngn2 lentivirüs ile iPS hücreleri nakletmek (2 gün) Oda sıcaklığında% 1 (h / h), penisilin / streptomisin ile sıcak 12 ml E8 ortamı. E8 ortama 8 ug / mL'lik bir nihai konsantrasyona kadar ROCK inhibitör ve polibren ile E8 orta ek. lentivirüs süspansiyon alikotları çözülme. lentivirüs süspansiyona 8 ug / mL'lik nihai bir konsantrasyona kadar polibren ekleyin. harcanan ortam aspire ve her bir hazırlanabilir E8 ortamın 1 ml. Ve Ngn2 -lentivirus süspansiyonlar – Farklı rtTA miktarlarda ile iletimini gerçekleştirmek. Örneğin, transdu12 yuvalı plakanın bir oyuğuna rtTA -lentivirus ve Ngn2 -lentivirus süspansiyonu her iki tarafından 100 uL eklenmesiyle hiPSCs ce. Diğer kuyular için, lentivirüs süspansiyon yerine 100 mcL 200 mcL, 300 uL, 400 uL ve 500 uL kullanın. 12 plaka iki kuyu hiPSCs transduse olmamalıdır; Onlar seçim sırasında kontrol olarak görev yapacak. NOT: transdüksiyon verimliliği (protokol adım 2.2.4) seçimi başladıktan sonra daha doğru tahmin edilebilir, böylece transdüksiyon tercihen iki kopya halinde gerçekleştirilir. etkin bir şekilde hiPSCs çoğunluğu transdüksiyonu için gerekli olan lentivirüs süspansiyon miktarı lentivirüs süspansiyonu ve kullanılan hiPSC hattının titresi bağlıdır. hiPSCs transdüksiyona lentivirüs süspansiyon 500 ul – Bu çalışmada, genelde 100 kullanımı. % 5 CO atmosferi ile nemlendirilmiş 37 ° C inkübatör içinde 12 gözlü plaka koyun6 saat boyunca 2. 6 saatlik inkübasyon süresi sona ermeden önce,% 1 (h / h), penisilin / streptomisin ve 12 sıcak 12 ml E8 ortamı oda sıcaklığına ml Dulbecco fosfat tamponlu tuz (DPBS). ROCK inhibitörü ile E8 orta tamamlar. harcanan E8 orta aspire. 1 mL DPBS ile de her bir yıkama. Her bir oyuğa hazırlanan E8 ortamının 1 ml. % 5 CO2 atmosferi olan nemlendirilmiş bir 37 ° C kuluçka makinesi içinde 12 oyuklu plaka O / N yerleştirin. E8 orta Yenile (3 gün) Oda sıcaklığına% 1 (h / h), penisilin / streptomisin ile sıcak 12 ml E8 ortamı. 12 gözlü bir levhanın gözleri harcanan ortam aspire ve her bir hazırlanmış E8 ortamın 1 ml. % 5 CO2 atmosferi olan nemlendirilmiş bir 37 ° C kuluçka makinesi içinde 12 oyuklu plaka O / N yerleştirin. Puromisin ve G418 (- 8 gün 4) ile seçim yapınız NOT: Hip hücre bölünmesi oranına bağlı olarakkültürler bölmek gerekir bu noktada seçim dönemi boyunca% 80 confluency – SC hattı ve lentiviral transdüksiyon verimliliği, hücreler 70 ulaşabilir. bölme zamanlaması önceden tahmin edilemez, çünkü bu protokolde değinilmeyecektir. Bununla birlikte, bunun yerine puromisin ve G418 belirtilen konsantrasyonları ile takviye edilmiş E8 orta yenilemek, bir (vitronektin kaplı plakalar üzerinde kaplama hücreleri de dahil olmak üzere), normal hiPSC kültür olarak hiPSC kültürü ayırabilir. Bunun tek istisnası, E8 ve orta noktası devam antibiyotik belirtilen konsantrasyonları ile takviye edilmesi gerektiğidir. Oda sıcaklığında% 1 (h / h), penisilin / streptomisin ile sıcak 12 ml E8 ortamı. seçim puromisin ve G418 ekleyin; antibiyotiklerin farklı miktarlarda ayıklanma periyodu (tabela 1) esnasında ilave edilir. G418- ve puromycin yüzdesini tahmin edilerek transdüksiyon etkinliğini tahmindayanıklı hücreleri. Dirençli bir hücre yüzdesi tahmin etmek için, farklı koşullar (lentivirüs süspansiyon farklı miktarları ile transduse kültürler) ölü hücrelerin yüzdesi (nonresistant hücreleri) tahmin etmek ve nontransduced hücreleri (bir seçme kontrol olarak hizmet hücreler) dir. [- (Ölü hücrelerin yüzdesi)% 100] olarak dirençli hücrelerin yüzdesini hesaplayın. Not: lentivirüs süspansiyon farklı miktarları ile transdüksiyon iki kez gerçekleştirildi ise, transdüksiyon verimliliği daha doğru bir şekilde tahmin edilebilir. transdüksiyona hücreleri ile durumu seçim kontrolü olarak hizmet eder; lentivirüs süspansiyon farklı miktarları ile kalıt kültürleri için ölü hücrelerin yüzdesi, daha düşük olmalıdır. Dirençli bir hücre tahmini yüzdesi büyük olasılıkla Her iki transgen açısından pozitif olan hiPSCs seçmek için kullanılır. Genel olarak, hücrenin>% 90 iletim durumundan hiPSCs vardı seçims 5 d seçme dönemi hayatta. hiPSCs harcanan aracı maddesi aspire ve çukurlara hazırlanan E8 ortamın 1 ml. % 5 CO2 atmosferi olan nemlendirilmiş bir 37 ° C kuluçka makinesi içinde 12 oyuklu plaka O / N yerleştirin. G418 nihai konsantrasyonu Puromycin nihai konsantrasyonu 4. gün 250 ug / ml 2 ug / ml 5. gün 250 ug / ml 2 ug / ml 6. gün 250 ug / ml 1 ug / ml 7. gün 250 ug / ml 1 ug / ml 8. gün 250 ug / ml 1 ug / ml Tablo 1: Seçim Döneminde Antibiyotiklerin konsantrasyonları. </stRong> Seçim dönemi 5 gün boyunca puromycin ve G418 konsantrasyonları. Seçim durdurun ve düzenli kültürlenmesini (daha sonra gün 9 ve) başlatın Hücre E8 orta / ml ve puromisin ile bir nihai konsantrasyona kadar 50 ug bir son konsantrasyona kadar G418 ile desteklenmiş haricinde 5 d seçme süresi, normal hiPSCs olarak rtTA / Ngn2 pozitif hiPSCs, kültür, sonra 0.5 ug / mL. NOT: Hücreler artık yedek olarak hizmet etmek (hücrelerin dondurulması için standart protokollere göre) dondurulabilir. Birçok gelecek farklılaşma deneyler için rtTA / Ngn2 pozitif hiPSCs aynı parti kullanımını sağlar, çünkü bu, farklılaşma protokolünün tekrarlanabilirlik için önemli bir adımdır. 6-kuyu üzerinde nöronlar için rtTA / Ngn2 pozitif hiPSCs 3. FarklılaşmaÇÇA ve Cam Lameller NOT: Bu protokol, ayrıntıları iki farklı yüzeylerde, yani 6-iyi ÇÇA ve cam lamelleri içinde (kuyu başına 9 kayıt ve 1 referans gömülü mikroelektrotla 6 bağımsız kuyuların oluşan cihazlar) üzerinde rtTA / Ngn2 pozitif hiPSCs ayrımında verilmektedir 24 gözlü bir levhanın gözleri. Protokoller, ancak kolayca yüzey alanına göre bahsedilen değerleri ölçekleme, (12 ya da 6-delikli plakalara için, örneğin) büyük yüzeyler için uyarlanabilir. ÇÇA ya da cam lamelleri (gün 0 ve 1) Hazırlama farklılaşma başlamasından bir gün önce, üreticinin tavsiyesine göre ÇÇA sterilize. yapışma proteini Poli-L-ornitin (PLO) aşırı saf, steril su içinde son konsantrasyon 50 ug / mL'ye seyreltilir. Coat 100 uL koyarak 6-iyi ÇÇA aktif elektrot alanıHer iyi seyreltilmiş FKÖ'nün bırakın. Steril cımbız kullanılarak 24 oyuklu plakanın kuyucuklarında lamelleri yerleştirin. her bir ile seyreltilmiş PLO 800 uL ekleyin. 1000 uL pipet ile onları iterek yüzen lamelleri önleyin. % 5 CO2 atmosferi ile 6 oyuklu ölçümü ve 24 plaka göre O / N nemlendirilmiş 37 ° C inkübatör inkübe edin. Ertesi gün, seyreltilmiş FKÖ'yü aspire. aşırı saf, steril su ile iki kez 6 oyuklu ÇÇA cam yüzeyleri ve lamelleri yıkayın. nihai (6-çukurlu ölçümü için), 20 ug / ml konsantrasyonda ve (cam lamelleri) 10 ug / ml soğuk DMEM / F12 laminin seyreltilir. Hemen kaplama her bir bir 100 uL damla yerleştirerek 6 oyuklu ÇÇA aktif elektrot alanı. Benzer şekilde, kat 24 oyuklu plakanın her bir ile seyreltilmiş laminin lamelleri 400 uL ekleyin. 1000 uL pipet ile onları iterek yüzen lamelleri önleyin. En az 2 saat boyunca% 5 CO2 atmosferi olan nemlendirilmiş bir 37 ° C kuluçka makinesi içinde 6 oyuklu ölçümü ve 24 yuvalı plaka inkübe edin. HiPSCs Plate (gün 1) Not: adımda 3.2.1 açıklanan miktarlar – 3.2.4 rtTA / Ngn2 pozitif hiPSCs 6 oyuklu plaka içerisinde kültürlenmiş olduğu ve bir kuyunun hücreler hasat varsayalım. 6-çukurlu ölçümü ve / veya lamelleri hücreleri kaplama için gerekli olan miktarlar 6 oyuklu ölçümü ve / veya deneyde kullanılan lamelleri sayısına sayısına bağlıdır; adımlarda 3.2.6 belirtilen numaraları – 3.2.8 farklı deney boyutları ölçekleme izin verir. Sıcak DMEM / F12, CDS ve R / T% 1 (v / v) penisilin / streptomisin ile E8 orta. E8 ortamına son 4 ng / ml konsantrasyonda ve kaya inhibitörüne doksisiklin ekleyin. RtTA / Ngn2 pozitif hiPSCs harcanan orta aspire ve 1 m eklemekhiPSCs L CDS. % 5 CO2 atmosferi olan nemlendirilmiş bir 37 ° C kuluçka makinesi içinde 5 dakika – 3 inkübe edin. Hücreler birbirlerinden ayrılmakta olup olmadığını mikroskop altında kontrol edin. nazikçe 1.000 uL pipet ile hücreleri askıya ve 15 ml tüp hücreleri aktarmak, kuyuda 2 ml DMEM / F12 ekleyin. Hücre süspansiyonuna 7 ml DMEM / F12 ekleyin. 5 dakika boyunca 200 xg'de hücreleri dönerler. Süpernatantı aspire ve hazırlanan E8 orta 2 mL ekleyin. 15 ml tüpün kenarına 1000 uL pipet ucu koyarak ve yavaşça yeniden süspansiyona alınmasıyla hiPSCs ayrıştırmaları. Hücreler ayrışmış olup olmadığını mikroskop altında kontrol edin. Bir hemositometre odasını kullanan hücreler (hücre / ml) sayısını belirler. NOT: 80 de A 6-plaka – toplam 4,0 x 10 6 hücre -% 90 confluency tipik 3.0 verecektir. seyreltilmiş laminin aspire. 6-çukurlu ölçümü için, CE elde etmek için hücreleri sulandırmak7.5 x 10 5 hücre / mL ll süspansiyonu. 6-çukurlu ÇÇA her çukuruna aktif elektrot alanı hücre süspansiyonunun 100 uL bir damla eklenerek hücreler plaka. Lamelleri için, 4.0 x 10 4 hücre / mL'lik bir hücre süspansiyonu elde etmek için hücreleri seyreltin. 24 oyuklu bir plakanın oyuklarına hücre süspansiyonu 500 ul ilave edilerek hücreler plaka. Not: ÇÇA ilgili nihai hücre yoğunluğu lamelleri (Şekil 1 A ve B) daha yüksektir. Bu yüksek hücre yoğunluklu ağ aktivite uygun kayıt için gerekli olduğu bulunmuştur. Protokolde, sayılar deneyleri için optimum olduğu daha önce ortaya çıktı sağlanmaktadır. 2 saat (Ölçüm) ya da O / N (24 boşluklu plaka) için% 5 CO2 atmosferi olan nemlendirilmiş bir 37 ° C kuluçka makinesi içinde 6 oyuklu ölçümü ve 24 yuvalı plaka koyun. 2 saat sonra, dikkatli bir şekilde 6-çukurlu ÇÇA her oyuğuna hazırlanan E8 ortamının 500 uL ekleyin. 6-biz koyunO taraflı çevre LL /% 5 CO2 atmosferi olan nemlendirilmiş bir 37 ° C kuluçka makinesi içinde n. Orta değiştirmek (2 gün) Sonraki gün,% 1 (h / h), N-2 ek,% 1 (h / h) temel olmayan amino asitler ve% 1 (h / h), penisilin / streptomisin içeren DMEM / F12 hazırlar. Ekleme insan rekombinant nörotrofin-3 (NT-3) 4 ug bir son konsantrasyona kadar bir son 10 ng / ml'lik bir nihai konsantrasyona kadar 10 ng / ml insan rekombinant beyin türevli nörotrofik faktör (BDNF) konsantrasyonu ve doksisikline / ml. 37 ° C'ye kadar ortam ısıtın. ortama 0.2 ug / ml'lik bir nihai konsantrasyona kadar laminin ekleyin. Elde edilen orta filtre. 6-çukurlu ÇÇA kuyulardan harcanan orta ve 24 oyuklu plaka aspire ve hazırlanan ortam maddesi ile değiştirin. % 5 CO2 atmosferi ile 6 oyuklu ölçümü ve 24 plaka göre O / N nemlendirilmiş 37 ° C inkübatör inkübe edin. Sıçan astrositler ekleyin (3 gün) <br/> NOT: Bu protokolde belirtilen hacimleri sıçan astrositler T75 kültür şişelerinde kültüre olduğunu varsayıyorum. Kültürlere ilave edilir sıçan astrositler iyi kalitede olmasını önemlidir. Biz sıçan astrositler kaliteli olup olmadığını kontrol etmek için iki kriter kullanın. İlk olarak, sıçan astrosit kültürü sıçan embriyonik beyinleri izolasyon sonra on gün içinde konfluent büyümek gerekir. İkinci olarak, sıçan astrosit kültürü ayrıldıktan sonra, sıçan astrositler konfluent, baklava tek tabaka (Şekil 1C) oluşturmak için mümkün olmalıdır. Sıçan astrosit kültürü bu iki kriterleri yerine getirmez ise, biz farklılaşma deneyleri için bu kültürü kullanmamanızı öneririz. Oda sıcaklığına kadar ısınmaya% 0.05 tripsin-EDTA. 37 ° C'de% 1 (h / h), penisilin / streptomisin DPBS ve DMEM / F12 ısıtın. Sıçan astrosit kültürü harcanan orta aspire. 5 ml DPBS ekleyerek kültür yıkayın ve çevresinde yavaşça homoseksüel. AspirDPBS yedi ve 5 mL% 0.05 tripsin-EDTA ekleyin. etrafında yavaşça tripsin-EDTA homoseksüel. 10 dakika – 5 5% CO2 atmosferi olan nemlendirilmiş bir 37 ° C kuluçka makinesi içinde inkübe edin. Hücreler müstakil olup olmadığını mikroskop altında kontrol edin. Şişe bir kaç kez vurarak son hücreleri ayırmak. şişeye DMEM / F12 5 mL ekleyin. 10 ml pipet ile balon içerisinde hafifçe hücreleri çiğnemek. 15 ml bir tüp içinde bir hücre süspansiyonu toplanır. 8 dakika boyunca 200 xg'de tüp Spin. Süpernatant aspire ve DMEM / F12 1 mL tekrar süspansiyon hücreleri. Bir hemositometre odasını kullanan hücreler (hücre / ml) sayısını belirler. 6-çukurlu ÇÇA oyuk başına 7.5 x 10 4 astrositler ekleyin. 24 çukurlu levha başına 2.0 x 10 4 astrositler ekleyin. / N,% 5 CO2 atmosferi olan nemlendirilmiş bir 37 ° C kuluçka makinesi içinde ölçümü ve 24 oyuklu plaka O inkübe edin. Orta değiştirmek (gün 4) <li>% 2 (hac / hac) B-27 takviyesi,% 1 (h / h) L-alanil-L-glutamin ve% 1 (h / h), penisilin / streptomisin ile, Neuro temelli vasat hazırlayın. 4 mg / ml bir son konsantrasyona kadar 10 ng / mL ve doksisiklin nihai bir konsantrasyona kadar 10 ng / mL, BDNF nihai konsantrasyona NT-3 ekle. Buna ek olarak, 2 uM bir konsantrasyona sitozin β-D-arabinofuranosid ekleyin. Not: Sitosin β-D-arabinofuranosid astrosit proliferasyonunu inhibe ettiği ve nöronlara ayırt ancak geriye kalan hiPSCs öldürmek için ortama ilave edilir. 37 ° C'ye kadar ortam ve sıcak filtre. 6-çukurlu ÇÇA kuyulardan harcanan orta ve 24 oyuklu plaka aspire ve hazırlanan ortam maddesi ile değiştirin. % 5 CO2 atmosferi olan nemlendirilmiş bir 37 ° C kuluçka makinesi içinde 6 oyuklu ölçümü ve 24 oyuklu plaka koruyun. Orta Yenile (gün 6-28) NOT: 6 gün başlayarak, yarım yenilemeorta her iki gün. günden sonra 10, orta astrosit canlılığını desteklemek için FBS ile takviye edilmektedir. % 2 (v / v) B-27 takviyesi,% 1 (h / h) L-alanil-L-glutamin ve% 1 (h / h), penisilin / streptomisin ile, Neuro temelli vasat hazırlayın. 4 mg / ml bir son konsantrasyona kadar 10 ng / mL ve doksisiklin nihai bir konsantrasyona kadar 10 ng / mL, BDNF nihai konsantrasyona NT-3 ekle. 10. günde başlayarak kaynaktan da% 2.5 (h / h) FBS ile orta tamamlar. 37 ° C elde edilen orta ve sıcak filtre. 6-çukurlu ÇÇA oyuklarına ve 1000 uL pipet kullanılarak 24 oyuklu plaka harcanan ortamın yarısı çıkarın ve hazırlanmış ortam ile değiştirin. % 5 CO2 atmosferi olan nemlendirilmiş bir 37 ° C kuluçka makinesi içinde 6 oyuklu ölçümü ve 24 oyuklu plaka koruyun. 4. hiPSC türetilmiş Nöronlar nörofizyolojik Profili oluşturulması NOT: in sonra iki üç haftafarklılaşma duction, hiPSC türetilmiş nöronlar, farklı alt analizler için de kullanılabilir. Bu bölümde bazı alt analizlerin örnekleri hiPSC türetilen nöron nörofizyolojik profilini belirlemek için yapılabilir olduğu verilmiştir. ÇÇA kullanarak nöronal ağ etkinliğini karakterize ÇÇA kültüre hiPSC türetilen nöron elektrofizyolojik aktivite Telaffuz 20 dakika. Kayıt esnasında, 37 ° C'de sıcaklığı korumak ve MEA üzerinde nemli gaz (% 5 CO2,% 20 O2,% 75 N2) sabit bir yavaş akış şişirilerek ortamın buharlaştırılması ve pH değişiklikleri önlemek . 1200X büyütme (MEA 1060, MCS) sonra, MCS veri toplama kartı kullanarak 10 kHz sinyal örnek. Özel bir yazılım paketi 23 kullanarak verileri (başak ve patlama algılama) analiz. Tek hücreli elektrofizyolojik aktiviteyi karakterize </strong> dik bir mikroskop bir dalgıç sabit aşamalı kayıt odasına hiPSC-türetilen nöron hücreleri ihtiva eden kapak slipi aktarın. Spontan aksiyon potansiyeli-uyarılmış postsinaptik akımlar (sEPSC) 24 rekor 20 dk. sinirbilimsel programını kullanarak sinaptik etkinliği algıla. Nöronal morfoloji ve synapsin ifade karakterize Fix ve map2 için hiPSC türetilmiş nöronlar leke, synapsin-1/2, ve 22, 24, 25 PSD-95. Görüntü analiz yazılımı kullanılarak synapsin-1/2 ve PSD-95 puncta sayısını ölçmek.