בידול העצבי המהיר של גזע תאים המושרה pluripotent למדידת פעילות רשת על מערכי מייקרו-אלקטרודה

כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות חיה לטיפול ולשימוש אישרה ועדת טיפול בבעלי חיים, מרכז רפואי אוניברסיטת Radboud, הולנד, (RU-DEC-2011-021, מספר פרוטוקול: 77,073). בידוד תא גליה 1. והתרבות הערה: הפרוטוקול המובא כאן מבוסס על העבודה של מקארתי דה Vellis 19, ו פרוטוקול מפורט מאוד דומה האסטרוציטים עכבר זמין 20. כדי ליצור תרבויות עיקריות של האסטרוציטים קליפת מוח מן עובריים במוחות עכברים (E18), חולדה בהריון צריכה להיות מוקרבת, העוברים צריכים להיות שנקטפו מן הרחם, ואת המוח צריך להיות מבודד מן העוברים. כדי למלא בבקבוק T75, הקורטקס מ 2 מוח עוברי צריך להיות משולב. כחלופה, זמינים מסחרית האסטרוציטים מטוהרים וקפואים ניתן לרכוש. הכן את בקבוק תרבות T75 לדלל Poly-D- ליזין (PDL) בultrapure סטרילית, מים לריכוז סופי של 10 מיקרוגרם / מ"ל. הוסף 5 מ"ל של PDL בדילול אל הבקבוק תרבות T75. סוויש סביב בעדינות כדי להרטיב את משטח כל הגידול. מניחים את הבקבוק C חממה humidified 37 מעלות למשך 3 שעות. לשאוב PDL מהבקבוק. יש לשטוף את הבקבוק עם 3x 5 מ"ל מים סטריליים כדי להסיר PDL מאוגד. לשאוב את המים לחלוטין. השאירו את הבקבוק להתייבש במנדף זרימה למינרית או להשתמש מיד. דיסקציה של הקורטקס הכן 50 בינוני לנתיחה מ"ל: בינוני L-15 של ליבוביץ עם 2% (v / v) תוספת B-27. שמור על הקרח. להרדים חולדה עמוק עם isoflurane בתא אינדוקציה (קופסת הפרספקס קטן) עד הנשימה נפסקת (~ 5 – 8 דקות). סור עכברוש מאולם האינדוקציה מורדם מייד נקע בצוואר רחם. תרסיס הבטן של חולדה עם 70% EtOH וימחה עודף. לחשוף ולהסיר את הרחם מן הסכר באמצעות secti קיסריעל בעזרת זוג מספריים 21. חותכים עוברים בודד הצ'קים שלהם השפירים במספריים, מעבירים לצלחת פטרי סטרילית מלאה בינוני לנתיחה קרה, ולשמור על קרח. העבר עוברים שוב מנה חדשה, סטרילי 6 ס"מ פטרי מלאות בינוני לנתיחה קר. חלץ את המוח מן העוברים תחת מיקרוסקופ סטריאו. כדי לחשוף את המוח, בעדינות לקלף את עור הגולגולת באמצעות מלקחיים. בעדינות לגרוף את כל המוח ולהעביר לצלחת פטרי 35 מ"מ עם מדיום לנתיחה טרי וקר. הערה: מוח פריטים הגזורים מעוברים ניתן לאחסן במדיום לנתיחה על קרח למשך שעות רבות מבלי לאבד כדאיות הסלולר. הפרד את שתי ההמיספרות של המוח כל על ידי חיתוך דרך קו האמצע עם מספריים באביב שקצהו קנס או אזמל. בזהירות להפשיט את קרומי המוח עם מלקחיים ישר שקצהו בסדר. הערה: חשוב מאוד להסיר את קרומי המוח לגמרי. thהוא זיהום פיברובלסטים מונע התרבות astrocyte. פיברובלסטים הם חלוקת תאים במהירות ובסופו של דבר יתפוס את מקומו של התאים האחרים. הסר את המוח התיכון / בסטריאטום ואת פקעת ההרחה במספריים באביב או אזמל. כמו כן יש לוודא להסיר את ההיפוקמפוס (C בצורת מבנה זה perimedian ואת הזנב ביחס הקורטקס) עם מספריים באביב או אזמל. אסוף ההמיספרות בקליפת המוח צינור צנטריפוגות 15 מ"ל מלאים 5 בינוני לנתיחה מ"ל. שמור על הקרח. דיסוציאציה של קליפת המוח הכן 2 מ"ל Ca 2 + / Mg 2 + ללא תמיסת מלח מאוזן של האנק (HBSS) עם 0.25% טריפסין (בינוני דיסוציאציה). כן 50 מיליליטר גבוה גלוקוז בינוני של הנשר השונה של Dulbecco (DMEM) עם 15% (V / V) בסרום שור עוברי (FBS) ו -1% (v / v) פניצילין / סטרפטומיצין (מדיום תרבות) ולסנן לעקר. תנו רקמות ליישב לתחתית של התחתית צנטריפוגות. בזהירות כפיפירט כמה שיותר המדיום לנתיחה ככל האפשר מלמעלה הרקמה. שטפו את רקמת עם 5 מ"ל Ca 2 + / Mg 2 + ללא HBSS (ללא טריפסין) ולאפשר רקמות להתיישב בחלק התחתון של הצינור. בזהירות לשאוב את HBSS. הוסף בינוני דיסוציאציה מ"ל 2 קפיצי הצינור בעדינות לתערובת האנזים סביב הרקמה. דגירה באמבט מים 37 מעלות צלזיוס למשך 5-10 דקות. פליק הצינור כמה פעמים במהלך הדגירה כדי להתסיס את הרקמה. מיד triturate רקמת באמצעות קצה פיפטה 1,000 μL. הגדרת עוצמת pipetter לכ -800 μL. לשאוב את השברים להוציא בכוח על הצד של הצינור, ישירות מעל הקו הנוזל. עם זאת, מנסה למזער בועות או קצף. חזור על הפעולה עד הרקמה ניתק מספיק, כ -15 – 20x. הוסף 8 בינוני תרבות מ"ל כדי להשבית טריפסין. לערבב בעדינות על ידי היפוך הצינור מספר פעמים. לעבור את ההשעיה התא דרך מסננת תא 70 מיקרומטר להציב על גבי 50 מטרצינור צנטריפוגות L. יש לשטוף את הצינור 15 מ"ל עם המדיום תרבות ולסנן המדיום דרך מסננת תא לאסוף המדיום בצינור 50 מ"ל עם ההשעיה התא. יש לשטוף את מסננת התא כמה פעמים עם המדיום לתרבות. לאחר השטיפה, נפח הסופי צריך להיות בערך 20 – 25 מ"ל. גלולת התאים ב XG 200 במשך 10 דקות. בזהירות לשאוב כמה שיותר בינוני ככל האפשר, בלי לגעת תא גלולה. Resuspend התאים בינוני תרבות 1 מ"ל בעזרת פיפטה μL 1000. הוסף בינוני תרבות מ"ל prewarmed 11 ומערבבים בעדינות (כדי למנוע בועות) בעזרת פיפטה 10 מ"ל. יש לשטוף את הבקבוק T75 מצופה PDL פעם עם המדיום תרבות 5 מ"ל. לשאוב את המדיום ולהעביר את ההשעיה תא אל הבקבוק. כל התאים נמצאים ההשעיה הם מצופים, ואנו מוצאים את זה בדרך כלל מיותר לספור אותם, מאז האסטרוציטים לא ניתן להבדיל בין תאי אחרים ההשעיה. מניחים את הבקבוק לתוך C חממה humidified 37 מעלות עם אווירה של f 5% CO 2או יומיים. הרחבה ותחזוקה של האסטרוציטים החלף את המדיום כולו עבור ד בפעם הראשונה 2 לאחר ציפוי ראשוני. החלף את המדיום כולו לאחר מכן כל 3 ד. תמיד prewarm המדיום טרי עד 37 ° C לפני הוספת לתאים. הערה: האסטרוציטים דורשים 7 – 10 ד צפויים להגיע ל 90% confluency (האסטרוציטים מופיעים בשכבת פסיפס צפופה, עם המיקרוגליה oligodendrocytes שוכבים על גבי ומעורבבים). כאשר האסטרוציטים להגיע לכ 90% confluency, לנער את הבקבוק כדי להסיר את תאי גליה המזהמים: הסר את הבקבוק מן החממה להדק את המכסה (פנוליות) או לכסות את הנמל (מסונן). כדי להסיר microglia, לנער את הבקבוק על פלטפורמת מסלולית ב 180 סל"ד במשך 1 שעה. לשאוב את המדיום. יש לשטוף מיד עם 5 מ"ל מחומם מראש בינוני תרבות, לשאוב ולהחליף עם 12 בינוני תרבות מ"ל. כדי להסירoligodendrocytes, להחזיר את הבקבוק אל הרציף מסלולית ולנער ב 250 סל"ד, 37 ° C למשך תקופה מינימלית של 7 שעות, אך רצוי O / N. לשאוב את המדיום. יש לשטוף מיד עם 5 מ"ל מחומם מראש בינוני תרבות, לשאוב ולהחליף עם 12 בינוני תרבות מ"ל. מחזירים את הבקבוק אל האינקובטור. כאשר 100% ומחוברות, לפצל את האסטרוציטים באמצעות נהלים סטנדרטיים לפי יחס של 1: 3 ל -1: 2 עם 0.05% טריפסין-ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA). בבקבוק T75 ב -100% confluency בדרך כלל יניב כ 4.0 x 10 6 תאים בסך הכל. תחת לוח זמנים זה, התרבויות ניתן לבצע בדרך כלל לפצל פעם בשבוע. הערה: כאשר האסטרוציטים להגיע confluency, הם יכולים להיות שנקטפו ומשומשים לבידול hiPSC כמתואר להלן בשלב פרוטוקול 3.4. האסטרוציטים ניתן לפצל לפחות פעם אחת ללא הפסד ניכר של כדאיות. הם יכולים להישמר עד 2 חודשים בתרבות. מניסיון, האסטרוציטים עוברי חולדה יום העיקרי 18 progressively להיות מובחנים סופני ו / או לאבד את יכולת הקיום לאחר פיצול חזר. למרות שזה אפשרי להקפיא את האסטרוציטים לשימוש עתידי, אנחנו מעדיפים לבודד את האסטרוציטים מן המוח העוברי טריים בעת הצורך. דור 2. rtTA / Ngn2 -positive hiPSCs הערה: hiPSCs המשמשים בניסויים שלנו נוצרו בתוך הבית על ידי התמרה lentiviral של פיברובלסטים האדם עם תכנות מחדש גורמי cMYC, Sox2, Oct4 ו KLF4. הערה: עבור הדור של rtTA / Ngn2 -positive hiPSCs, וקטורים lentiviral משמשים לשלב את transgenes ביציבות לתוך הגנום של hiPSCs. הפרוטוקול לייצור של lentivirus שפורסם בעבר 22. הפרטים של וקטורי אריזת lentiviral המשמשים לייצור חלקיקי lentivirus rtTA ו Ngn2 ניתנים <sטרונג> לוח של חומרים / ציוד. וקטור ההעברה המשמש lentivirus rtTA הוא pLVX-EF1α- (ט-און-מתקדם) -IRES-G418 (R); כלומר וקטור זה מקודד ט-האון מתקדם transactivator תחת שליטה של מקדם EF1α מכונן מקנה עמידות בפני G418 האנטיביוטי. וקטור ההעברה המשמש lentivirus Ngn2 הוא pLVX- (TRE-thight) – (עכבר) Ngn2-PGK-puromycin (R); כלומר וקטור זה מקודד גן neurogenin-2 murine תחת שליטה של מקדם ט שבשליטת ואת גן התנגדות puromycin תחת השליטה של מקדם PGK מכונן. לפיכך, באמצעות וקטורי העברת שני אלה, קו hiPSC ניתן ליצור עבורו את הביטוי של neurogenin-2 בעכברים יכול להיגרם על ידי השלמה הבינונית עם דוקסיציקלין. עבור התמרה של hiPSCs, supernatant עם חלקיקים lentivirus משמש (המכונה "ההשעיה lentivirus 'ב שאר הטקסט), כלומר שנינותHout ריכוז חלקיקים באמצעות ultracentrifugation. פלייט hiPSCs (יום 1) הערה: כרכים המוזכרים בפרוטוקול זה להניח כי hiPSCs בתרבית צלחת 6 היטב כי התאים של באר אחת נקצרים. בנוסף, ההנחה היא כי התאים מצופה מכן ב -12 בארות צלחת 12 היטב. הכן 10 מ"ל קר DMEM / F12 עם 1% (v / v) מרתף מטריקס ממברנה (BMM) להשיג מדולל BMM. להוסיף 800 μL בדילול BMM לכל גם צלחת 12 באר. דגירה עבור h 1 לפחות C חממה humidified 37 מעלות עם אווירה של 5% CO 2. לפני השימוש, דגירת הצלחת של 1 ש 'ב RT. בינוני חם 15 מ"ל Essential 8 (E8) עם 1% (v / v) פניצילין / סטרפטומיצין, 9 מ"ל DMEM / F12 ו- 1 פתרון ניתוק התא מ"ל (CDS) לטמפרטורת החדר. מוסף המדיום E8 עם קינאז חלבון הקשורים Rho (ROCK) מעכב. לשאוב את המדיום בילה של hiPSCsד להוסיף 1 מ"ל CDS אל hiPSCs. דגירה 3 – 5 דקות C חממה humidified 37 מעלות עם אווירה של 5% CO 2. בדוק תחת מיקרוסקופ אם התאים ניתוק זה מזה. הוסף 2 מ"ל DMEM / F12 בבאר, להשעות את התאים בעדינות עם טפטפת 1,000 μL ולהעביר את התאים צינור 15 מ"ל. להוסיף 7 מ"ל DMEM / F12 על השעיית התא. ספין התאים ב XG 200 במשך 5 דקות. לשאוב supernatant ולהוסיף 2 מ"ל של המדיום E8 מוכן. לקבל השעיה תא שבו hiPSCs הם ניתק (לא יוצרים גושים התא) על ידי הצבת קצה פיפטה 1,000 μL נגד הצד של הצינור 15 מ"ל ו resuspending התאים בעדינות. בדוק תחת מיקרוסקופ אם התאים הם ניתקו. לקבוע את מספר תאים (תאים / מ"ל) באמצעות תא hemocytometer. הערה: צלחת 6 היטב היטב ב 80 – 90% confluency יהיה בדרך כלל תשואה 3.0 – 4.0 x 10 6 תאים בסך הכל. לשאובבדילול BMM מבאר 12 את הצלחת היטב. לדלל את התאים כדי לקבל השעיה תא של 3.0 x 10 4 תאים / מ"ל. פלייט 1 מ"ל של ההשעיה תא לכל טוב של 12 את הצלחת היטב. מניחים 12 O הצלחת היטב / N C חממה humidified 37 מעלות עם אווירה של 5% CO 2. Transduce התאים iPS עם lentivirus rtTA ו Ngn2 (יום 2) מ"ל E8 חם 12 בינוני עם 1% (v / v) פניצילין / סטרפטומיצין לטמפרטורת החדר. מוסף המדיום E8 עם ROCK מעכב polybrene לריכוז סופי של 8 מיקרוגרם / מ"ל ​​למדיום E8. הפשרת aliquots עם השעית lentivirus. להוסיף polybrene לריכוז סופי של 8 מיקרוגרם / מ"ל ​​ההשעיה lentivirus. לשאוב את המדיום בילה ולהוסיף 1 מ"ל של המדיום E8 מוכן היטב כל אחד. בצע התמרה עם כמויות שונות של rtTA – השעיות -lentivirus Ngn2. לדוגמה, transduלספירת hiPSCs על ידי הוספת 100 μL של שני -lentivirus rtTA ו Ngn2 השעית -lentivirus כדי גם אחד מ -12 ההצלחה היטב. עבור בארות אחרים, להשתמש 200 μL, 300 μL, 400 μL ו 500 μL ההשעיה lentivirus במקום 100 μL. HiPSCs של שתי בארות הצלחת 12 גם לא צריך להיות transduced; הם ישמשו כקבוצת ביקורת במהלך הבחירה. הערה: transductions הם רצוי ביצע בשני עותקים, כך יעילות התמרה ניתן לאמוד באופן מדויק יותר לאחר תחילת הבחירה (ראה שלב פרוטוקול 2.2.4). כמות ההשעיה lentivirus הנדרש ביעילות transduce רוב hiPSCs תלוי כייל של ההשעיה lentivirus וקו hiPSC המשמש. במחקר זה, אנו בדרך כלל משתמשים 100 – 500 μL של ההשעיה lentivirus כדי transduce hiPSCs. מניחים את צלחת 12 גם C חממה humidified 37 מעלות עם אווירה של 5% CO2 במשך 6 שעות. לפני תום תקופת הדגירה 6 שעות, חם 12 בינוני מ"ל E8 עם 1% (v / v) פניצילין / סטרפטומיצין ו -12 פוספט שנאגרו מלוחים של מ"ל Dulbecco (DPBS) RT. מוסף המדיום E8 עם מעכב ROCK. לשאוב את המדיום E8 בילו. לשטוף היטב עם כל 1 מ"ל DPBS. הוסף 1 מ"ל של המדיום מוכן E8 היטב כל אחד. מניחים 12 O הצלחת היטב / N C חממה humidified 37 מעלות עם אווירה של 5% CO 2. רענן מדיום E8 (יום 3) מ"ל E8 חם 12 בינוני עם 1% (v / v) פניצילין / סטרפטומיצין RT. לשאוב את המדיום בילה מבארות 12 את הצלחת היטב ולהוסיף 1 מ"ל של המדיום E8 מוכן היטב כל אחד. מניחים 12 O הצלחת היטב / N C חממה humidified 37 מעלות עם אווירה של 5% CO 2. לבצע בחירה עם puromycin ו G418 (יום 4 – 8) הערה: בהתאם לשיעור חלוקת התא של הירךקו SC ואת היעילות של תמרת lentiviral, התאים עשויים להגיע ל -70 – 80% confluency בתקופת הבחירה, ובנקודת התרבויות צריכות להיות מפוצלות. בגלל העיתוי של פיצול לא ניתן לחזות מראש, זה לא יהיה המוזכרים בפרוטוקול. עם זאת, במקום לרענן את מדיום E8 השלים עם הריכוזים ציינו של puromycin ו G418, אפשר לפצל את תרבות hiPSC כתרבות hiPSC נורמלית (כולל ציפוי התאים על צלחות מצופות vitronectin). היוצא מן הכלל היחיד הוא כי המדיום E8 יש להשלימם עם ריכוזים ציינו של אנטיביוטיקה כדי להמשיך את הבחירה. מ"ל E8 חם 12 בינוני עם 1% (v / v) פניצילין / סטרפטומיצין לטמפרטורת החדר. הוספת puromycin ו G418 לבחירה; כמויות שונות של אנטיביוטיקה מתווספים בתקופת הבחירה (טבלה 1). להעריך את היעילות של התמרה על ידי אומדן אחוז G418- ו puromycinתאי -resistant. כדי להעריך את אחוז תאים עמידים, להעריך את אחוז התאים המתים (תאים nonresistant) עבור תנאים שונים (התרבויות transduced עם כמויות שונות של ההשעיה lentivirus) ועבור תאים nontransduced (התאים לשמש כביקורת מבחר). חישוב אחוזי התאים עמידים כמו [100% – (אחוז התאים המתים)]. הערה: אם transductions עם הכמויות השונות של השעית lentivirus בוצע בשני עותקים, את יעילות התמרה ניתן לאמוד באופן מדויק יותר. התנאי עם התאים שאינם transduced משמש כביקורת בחירה; האחוזים של תאים מתים על תרבויות transduced עם כמויות שונות של ההשעיה lentivirus צריך להיות נמוך יותר. האחוז המשוער של תאים עמידים משמש לבחור את hiPSCs כי הם חיוביים סביר לשני transgenes. באופן כללי, אנו בוחרים את hiPSCs ממצב התמרה היה> 90% של התאהים לשרוד את תקופת בחירת 5 ד. לשאוב את המדיום בילה של hiPSCs ולהוסיף 1 מ"ל של המדיום E8 מוכן הבארות. מניחים 12 O הצלחת היטב / N C חממה humidified 37 מעלות עם אווירה של 5% CO 2. ריכוז סופי של G418 ריכוז סופי של puromycin יום 4 250 מיקרוגרם / מ"ל 2 מיקרוגרם / מ"ל יום 5 250 מיקרוגרם / מ"ל 2 מיקרוגרם / מ"ל יום 6 250 מיקרוגרם / מ"ל 1 מיקרוגרם / מ"ל יום 7 250 מיקרוגרם / מ"ל 1 מיקרוגרם / מ"ל יום 8 250 מיקרוגרם / מ"ל 1 מיקרוגרם / מ"ל טבלה 1: ריכוז של אנטיביוטיקה בתקופת הבחירה. </stרונג> ריכוזים של puromycin ו G418 במהלך 5 ד תקופת הבחירה. עצור את הבחירה ולהתחיל culturing רגיל (יום 9 ואילך) לאחר תקופת הבחירה 5 ד, בתרבות hiPSCs -positive rtTA / Ngn2 כמו hiPSCs רגיל, למעט העובדה המדיום E8 של התאים הוא השלים עם G418 לריכוז סופי של 50 מיקרוגרם / מ"ל ועם puromycin לריכוז סופי של 0.5 מיקרוגרם / מ"ל. הערה: התאים אפשר להקפיא עכשיו (על פי פרוטוקולים סטנדרטיים עבור cryopreservation של תאים) כדי לשמש כגיבוי. זהו צעד חשוב עבור השחזור של פרוטוקול הבידול, משום שהיא מאפשרת את השימוש של אצווה הזהה של hiPSCs rtTA / Ngn2 -positive לניסויי בידול עתידיים רבים. בידול 3. rtTA / Ngn2 hiPSCs -positive כדי נוירונים ב -6 היטבMEAs וזכוכית Coverslips הערה: בפרוטוקול זה, את הפרטים ניתנים להבחנה rtTA / Ngn2 hiPSCs -positive על שני מצעים שונים, כלומר 6 באר MEAs (מכשירים מורכב 6 בארות עצמאית עם 9 הקלטה 1 התייחסות microelectrodes מוטבע לכל טוב) וזכוכית coverslips ב הבארות של צלחת 24 גם. הפרוטוקולים, עם זאת, ניתן להתאים בקלות על מצעים גדולים (למשל, עבור הבארות של 12 או 6 צלחות גם), על ידי דרוג את הערכים שהוזכרו על פי שטח הפנים. הכן את MEAs או coverslips זכוכית (יום 0 ויום 1) היום לפני תחילת הבידול, לעקר את MEAs פי המלצת היצרן. לדלל את החלבון הדבק פולי-L-ornithine (אש"ף) במי ultrapure סטרילית לריכוז סופי 50 מיקרוגרם / מיליליטר. מעיל באזור האלקטרודה פעילה של MEAs 6-היטב על ידי הצבת 100 μLטיפה של אש"ף המדולל היטב כל אחד. מניחים את coverslips בבארות של צלחת 24 גם באמצעות פינצטה סטרילית. להוסיף 800 μL של אש"ף המדולל היטב כל אחד. למנוע את coverslips לצוף על ידי דחיפה אותם עם קצה פיפטה 1000 μL. דגירה MEAs 6-היטב O צלחת 24 גם / N C חממה humidified 37 מעלות עם אווירה של 5% CO 2. למחרת, לשאוב את אש"ף המדולל. שטוף את משטחי הזכוכית של MEAs 6-היטב את coverslips פעמים עם מי ultrapure סטרילית. לדלל laminin ב DMEM / F12 קר לריכוז סופי של 20 מיקרוגרם / מ"ל ​​(עבור MEAs 6 גם) ו -10 מיקרוגרם / מ"ל ​​(עבור coverslips זכוכית). מיד המעיל באזור האלקטרודה הפעיל של MEAs 6-היטב על ידי הצבת ירידה 100 μL בכל טוב. באופן דומה, להוסיף 400 μL של laminin מדולל היטב בכל צלחת 24 היטב כדי לצפות את coverslips. למנוע את coverslips לצוף על ידי דחיפה אותם עם קצה פיפטה 1,000 μL. דגירה את הצלחת MEAs 6 באר ו -24 גם C חממה humidified 37 מעלות עם אווירה של 5% CO 2 עבור h 2 לפחות. פלייט hiPSCs (יום 1) הערה: כרכים המוזכרות צעדים 3.2.1 – 3.2.4 להניח כי rtTA / Ngn2 hiPSCs -positive בתרבית צלחת 6-היטב כי התאים של באר אחת נקצרים. הכרכים הנדרשים ציפוי התאים על MEAs 6 באר ו / או coverslips תלוי במספר של 6 באר MEAs ו / או מספר coverslips המשמשים בניסוי; המספרים המפורטים צעדים 3.2.6 – 3.2.8 לאפשר דרוג לגדלים שונים של ניסויים. DMEM / F12 חם, CDS ובינוניים E8 עם 1% (v / v) פניצילין / סטרפטומיצין R / T. להוסיף דוקסיציקלין לריכוז סופי של 4 מיקרוגרם / מ"ל ​​ו ROCK מעכב למדיום E8. לשאוב את המדיום בילה של hiPSCs -positive rtTA / Ngn2 ולהוסיף 1 מ 'CDS L אל hiPSCs. דגירה 3 – 5 דקות C חממה humidified 37 מעלות עם אווירה של 5% CO 2. בדוק תחת מיקרוסקופ אם התאים ניתוק זה מזה. הוסף 2 מ"ל DMEM / F12 בבאר, להשעות את התאים בעדינות עם טפטפת 1,000 μL ולהעביר את התאים צינור 15 מ"ל. להוסיף 7 מ"ל DMEM / F12 על השעיית התא. ספין התאים ב XG 200 במשך 5 דקות. לשאוב supernatant ולהוסיף 2 מ"ל של המדיום E8 מוכן. לנתק את hiPSCs ידי הצבת קצה פיפטה 1,000 μL על הצד של 15 הצינור מ"ל ו resuspending התאים בעדינות. בדוק תחת מיקרוסקופ אם התאים הם ניתקו. לקבוע את מספר תאים (תאים / מ"ל) באמצעות תא hemocytometer. הערה: צלחת 6 באר היטב ב 80 – 90% confluency יהיה בדרך כלל תשואה 3.0 – 4.0 x 10 6 תאים בסך הכל. לשאוב את laminin המדולל. עבור MEAs 6-היטב, לדלל את התאים כדי לקבל לסה"נll ההשעיה של 7.5 x 10 5 תאים / מ"ל. פלייט התאים על ידי הוספת ירידה של 100 μL של השעית התא על אזור אלקטרודה הפעיל בכל טוב של MEAs 6 באר. עבור coverslips, לדלל את התאים כדי לקבל השעיה תא של 4.0 x 10 4 תאים / מ"ל. פלייט התאים על ידי הוספת 500 μL של ההשעיה תא אל בארות הצלחת 24 גם. הערה: צפיפות התא הסופית על MEAs היא גבוהה יותר מאשר על coverslips (איור 1 א 'וב'). מצאנו כי צפיפות תא גבוהה זו נדרשה להקלטה תקינה של פעילות הרשת. בפרוטוקול, המספרים ניתנים שהתבררו להיות אופטימלי עבור המבחנים. מניחים את MEAs 6-היטב 24 צלחת יפה C חממה humidified 37 מעלות עם אווירה של 5% CO 2 על 2 h (MEAs) או O / N (צלחת יפה 24). לאחר 2 שעות, להוסיף בזהירות 500 μL של המדיום מוכן E8 היטב כל של MEAs 6 באר. מניחים את 6-אנחנוll MEAs O / N C חממה humidified 37 מעלות עם אווירה של 5% CO 2. שינוי המדיום (יום 2) למחרת, להכין DMEM / F12 עם 1% (v / v) תוספת N-2, 1% (v / v) שאינם חיוניים חומצות אמינו 1% (v / v) פניצילין / סטרפטומיצין. הוסף רקומביננטי אנושי neurotrophin-3 (NT-3) לריכוז סופי של 10 ng / mL, גורם נוירוטרופי שמופק מהמוח רקומביננטי אנושי (BDNF) לריכוז סופי של 10 ng / mL, ו דוקסיציקלין לריכוז סופי של 4 מיקרוגרם / מ"ל. מומלץ לחמם את הבינוני עד 37 ° C. להוסיף laminin לריכוז סופי של 0.2 מיקרוגרם / מ"ל ​​למדיום. מסנן המדיום שהתקבל. לשאוב את המדיום בילה מבארות של MEAs 6-היטב את הצלחת 24 גם ולהחליפה המדיום מוכן. דגירה MEAs 6-היטב O צלחת 24 גם / N C חממה humidified 37 מעלות עם אווירה של 5% CO 2. להוסיף האסטרוציטים חולדה (יום 3) <br/> הערה: כרכים המוזכרים בפרוטוקול זה להניח כי האסטרוציטים עכברוש מתורבתים צלוחיות תרבות T75. זה קריטי, כי האסטרוציטים העכברוש שנוספים התרבויות הם באיכות טובה. אנו משתמשים בשני קריטריונים כדי לבדוק אם האסטרוציטים העכברוש הם באיכות טובה. ראשית, תרבות astrocyte העכברוש אמורה להיות מסוגל לגדול ומחוברות בתוך עשרה ימים לאחר במנותק מן המוח העוברי החולדה. שנית, לאחר פיצול תרבות astrocyte חולדה, האסטרוציטים העכברוש אמורים להיות מסוגלים ליצור monolayer ומחוברת, פסיפס (איור 1 ג). אם תרבות העכברוש astrocyte אינה ממלאת שני קריטריונים אלה, אנו ממליצים לא להשתמש תרבות זו לניסויי בידול. 0.05% טריפסין-EDTA חם RT. מומלץ לחמם את F12 DPBS ו DMEM / עם 1% (v / v) פניצילין / סטרפטומיצין ל -37 מעלות צלזיוס. לשאוב את המדיום בילה של התרבות astrocyte חולדה. שטפו את התרבות על ידי הוספת 5 מ"ל DPBS ו סוויש אותו סביב בעדינות. Aspirאכל את DPBS ולהוסיף טריפסין-EDTA מ"ל 0.05% 5. סוויש את EDTA טריפסין סביב בעדינות. דגירת C חממת humidified 37 מעלות עם אווירה של 5% CO 2 למשך 5 – 10 דקות. בדוק תחת מיקרוסקופ אם התאים מנותקים. לנתק את התא האחרון על ידי להכות את הבקבוק כמה פעמים. הוסף 5 מ"ל של DMEM / F12 אל הבקבוק. Triturate התאים בעדינות בתוך הבקבוק עם טפטפת 10 מ"ל. אסוף את ההשעיה תא צינור 15 מ"ל. לסובב את הצינור ב XG 200 עבור 8 דקות. לשאוב supernatant ו resuspend התאים 1 מ"ל של DMEM / F12. לקבוע את מספר תאים (תאים / מ"ל) באמצעות תא hemocytometer. להוסיף 7.5 x 10 4 האסטרוציטים לכל טוב של MEAs 6 באר. להוסיף 2.0 x 10 4 האסטרוציטים לכל טוב של צלחת 24 גם. דגירה MEAs ואת O צלחת 24 גם / N C חממה humidified 37 מעלות עם אווירה של 5% CO 2. שינוי המדיום (יום 4) <li> הכן בינוני neurobasal עם 2% (v / v) B-27 תוספת, 1% (v / v) L-alanyl-L- גלוטמין ו -1% (v / v) פניצילין / סטרפטומיצין. להוסיף NT-3 לריכוז סופי של 10 ng / mL, BDNF לריכוז סופי של 10 ng / mL, ו דוקסיציקלין לריכוז סופי של 4 מיקרוגרם / מ"ל. בנוסף, להוסיף ציטוזין β-D-arabinofuranoside לריכוז של 2 מיקרומטר. הערה: ציטוזין β-D-arabinofuranoside מתווסף בינוני לעכב התפשטות astrocyte וכדי להרוג את hiPSCs הנותרים שאינם הבחנה לתוך הנוירונים. מסנן המדיום וחם עד 37 מעלות צלזיוס. לשאוב את המדיום בילה מבארות של MEAs 6-היטב את הצלחת 24 גם ולהחליפה המדיום מוכן. שמירה על MEAs 6-היטב את הצלחת 24 גם C חממה humidified 37 מעלות עם אווירה של 5% CO 2. רענן המדיום (יום 6 – 28) הערה: החל מ יום 6, לרענן וחצישל המדיום כל יומיים. מהיום 10 ואילך, המדיום הוא השלים עם FBS לתמוך את הכדאיות astrocyte. הכן בינוני neurobasal עם 2% (v / v) תוספת B-27, 1% (v / v) L-alanyl-L- גלוטמין ו -1% (v / v) פניצילין / סטרפטומיצין. להוסיף NT-3 לריכוז סופי של 10 ng / mL, BDNF לריכוז סופי של 10 ng / mL, ו דוקסיציקלין לריכוז סופי של 4 מיקרוגרם / מ"ל. מהיום 10 ואילך, גם להשלים את המדיום עם 2.5% (v / v) FBS. סנן בינונית חמה וכתוצאה מכך ל -37 מעלות צלזיוס. הסר מחצית המדיום בילה מבארות של MEAs 6-היטב את הצלחת 24 גם בעזרת פיפטה μL 1000 ו להחליף אותו עם המדיום מוכן. שמירה על MEAs 6-היטב את הצלחת 24 גם C חממה humidified 37 מעלות עם אווירה של 5% CO 2. 4. להקים את הפרופיל הנוירופיזיולוגיים של נוירונים hiPSC הנגזרות הערה: שבועיים עד שלושה שבועות לאחר בduction של בידול, הנוירונים הנגזרים hiPSC יכול לשמש עבור ניתוחים במורד שונים. בסעיף זה, דוגמאות של ניתוחים במורד כמה מקבלות כי ניתן לבצע כדי לקבוע את הפרופיל הנוירופיזיולוגי של נוירונים נגזרים hiPSC. לאפיין את פעילות הרשת העצבית באמצעות MEAs שיא 20 דקות פעילות אלקטרו של נוירונים הנגזרות hiPSC בתרבית על MEAs. במהלך ההקלטה, לשמור על הטמפרטורה ב 37 מעלות צלזיוס, ולמנוע שינויי אידוי ו- pH של המדיום על ידי ניפוח זרם בלתי פוסק, איטי של גז humidified (5% CO 2, 20% O 2, 75% N 2) על MEA . לאחר הגברת 1200X (MEA 1060, MCS), לדגום את האות ב -10 קילוהרץ באמצעות כרטיס רכישת נתוני MCS. לנתח את הנתונים (ספייק וזיהוי פרץ) באמצעות חבילת תוכנה מותאמת אישית 23. המאפיין את פעילות התא הבודד אלקטרו </strong> מעביר את תלושי לכסות המכילים את התרבויות עצביות שמקורם hiPSC אל חדר הקלטה קבוע בשלב שקוע מיקרוסקופ זקוף. שיא 20 דקות של זרמי postsynaptic עורר פוטנציאל פעולה ספונטנית (sEPSC) 24. זיהוי האירוע הסינפטי באמצעות תוכנית neuroscientific. לאפיין את המורפולוגיה העצבית וביטוי synapsin תיקון ו להכתים את הנוירונים הנגזרות hiPSC עבור MAP2, synapsin-1/2, ו PSD-95 22, 24, 25. לכמת את מספר synapsin-1/2 ו PSD-95 puncta באמצעות תוכנת ניתוח התמונה.