Rápido Neuronal diferenciação de células estaminais pluripotentes induzidas para medir a atividade de rede na Arrays Micro-eletrodo

Todos os experimentos em animais foram realizados de acordo com os cuidados com os animais e utilizar as orientações aprovadas da Comissão de Cuidados com Animais, Radboud University Medical Centre, na Holanda, (RU-DEC-2011-021, protocolo número: 77073). 1. Glia isolamento de células e Cultura NOTA: O protocolo aqui apresentado é baseado na obra de McCarthy e de Vellis 19 anos, e um protocolo detalhado muito semelhante para os astrócitos do mouse está disponível 20. Para gerar culturas primárias de astrócitos corticais embrionárias a partir de cérebros de rato (E18), uma ratazana grávida tem de ser sacrificados, os embriões devem ser colhidas a partir do útero, e os cérebros precisa de ser isolado a partir dos embriões. Para encher um frasco T75, os córtices de 2 cérebros embrionários precisam ser combinados. Como uma alternativa, os astrócitos e purificados congelados disponíveis comercialmente podem ser comprados. Prepara-se o balão de cultura T75 Dilui-se com poli-D-lisina (PDL) emestéril, água ultrapura até uma concentração final de 10 ug / mL. Adicionar 5 ml da PDL diluída para o frasco de cultura T75. Swish ao redor delicadamente para molhar a superfície de crescimento inteira. Colocar o balão numa atmosfera humidificada a 37 ° C incubadora durante 3 h. Aspirar o PDL do frasco. Lavar as 3x frasco com 5 mL de água estéril para remover PDL não ligado. Aspirar a água completamente. Deixar o frasco a secar numa câmara de fluxo laminar ou usadas imediatamente. A dissecação dos córtices Preparar 50 ml de meio de dissecção: meio de Lebovitz G-15 com 2% (v / v) de B-27 suplemento. Manter em gelo. Anestesiar o rato profundamente com isoflurano em uma câmara de indução (caixa de pequenas Plexiglas) até que a respiração cessa (~ 5-8 min). Remover de rato a partir da câmara de indução e imediatamente sacrificados por deslocamento cervical. Pulverizar o abdómen do rato com etanol 70% e limpe o excesso. Expor e remover o útero da barragem via seç cesarianasobre o uso de um par de tesouras 21. Corte embriões individuais de suas bolsas amnióticas com uma tesoura, a transferência para uma placa de Petri estéril preenchido com meio de dissecção fria e manter em gelo. Transferir embriões novamente para uma nova e estéril seis centímetros de Petri com meio cheio dissecção fria. Extrair cérebros de embriões sob um microscópio estéreo. Para expor o cérebro, delicadamente descascar a pele e crânio usando uma pinça. Suavemente retire todo o cérebro e transferir para um 35 milímetros placa de Petri com meio de dissecação limpa e fria. NOTA: cérebros inteiros foram dissecados a partir de embriões podem ser armazenadas em meio de dissecção em gelo durante muitas horas sem perder viabilidade celular. Separar os dois hemisférios do cérebro cada cortando a linha média com uma tesoura de mola de ponta fina ou um bisturi. Cuidadosamente retirar as meninges com uma pinça de ponta fina retas. NOTA: É muito importante para remover as meninges completamente. ºé contaminação por fibroblastos previne a cultura de astrócitos. Os fibroblastos são células que se dividem rapidamente e, eventualmente, irá deslocar as outras células. Remova o mesencéfalo / estriado e bulbo olfativo com uma tesoura de mola e um bisturi. Também certifique-se de remover o hipocampo (estrutura em forma de C que é perimedian e caudal em relação ao córtex) com uma tesoura de mola e um bisturi. Recolher os hemisférios corticais em um tubo de 15 mL de centrífuga preenchido com 5 meio de dissecção mL. Manter em gelo. A dissociação dos córtices Preparar 2 mL de Ca 2+ / Mg 2+ livre de Solução Salina Equilibrada de Hank (HBSS) com tripsina a 0,25% (meio de dissociação). Preparar 50 ml de elevada glicose de Eagle Modificado Meio de Dulbecco (DMEM) com 15% (v / v) de Soro Fetal Bovino (FBS) e 1% (v / v) de penicilina / estreptomicina (meio de cultura) e esterilizar filtro. Deixe o tecido depositar-se no fundo do tubo de centrifugação. cuidado,pirata tanto do meio de dissecção quanto possível a partir de cima do tecido. Lavar o tecido com 5 mL de Ca 2+ / Mg 2+ livre de HBSS (sem tripsina) e permitir que o tecido para assentar no fundo do tubo. Aspirar cuidadosamente a HBSS. Adicionar 2 mL de meio de dissociação e apertar o tubo suavemente para misturar a enzima em torno do tecido. Incubar em um banho de água a 37 ° C durante 5-10 min. Flick o tubo algumas vezes durante a incubação para agitar o tecido. Imediatamente triturar o tecido usando uma ponteira de 1.000 mL. Definir o volume de pipeta para cerca de 800 mL. Aspirar as peças e ejectar força para o lado do tubo, imediatamente acima da linha de fluido. No entanto, tentar minimizar bolhas ou espuma. Repetir até que o tecido é suficientemente dissociadas, cerca de 15 – 20x. Adiciona-se 8 mL de meio de cultura para inactivar a tripsina. Misture suavemente invertendo o tubo várias vezes. Passar a suspensão de células através de um coador de células de 70 uM colocado no topo de uma 50 mG tubo de centrífuga. Lavar o tubo de 15 mL com meio de cultura e o meio filtrar através do filtro de células para recolher o meio no tubo de 50 mL com a suspensão de células. Lavar o filtro de células algumas vezes com meio de cultura. Após lavagem, o volume final deve ser de cerca de 20 – 25 ml. Agregar as células a 200 xg durante 10 min. Aspirar cuidadosamente tanto forma possível, sem tocar no sedimento celular. Ressuspender as células em 1 mL de meio de cultura usando uma pipeta de 1000 mL. Adicionar 11 mL de meio de cultura previamente aquecido e misturar suavemente (para evitar bolhas) utilizando uma pipeta de 10 mL. Lavar o balão T75 PDL revestido de uma vez com 5 mL de meio de cultura. Aspirar o meio e transferir a suspensão de célula para o balão. Todas as células estão em suspensão são plaqueadas, e considera-se geralmente desnecessário de contá-las, uma vez que os astrócitos não podem ser diferenciados a partir de outras células na suspensão. Colocar o balão em atmosfera humidificada a 37 ° C incubadora com uma atmosfera de 5% de CO 2 Fou dois dias. Expansão e manutenção dos astrócitos Substituir a forma inteira pela primeira vez 2 d após o plaqueamento inicial. Substituição de todo o meio depois a cada 3 d. Sempre Pré-aquecer o meio fresco a 37 ° C antes de adicionar às células. NOTA: Os astrócitos exigem 7-10 d para atingir aproximadamente 90% de confluência (astrócitos aparecer como uma monocamada tessellated densamente, com microglia e oligodendrócitos deitado em cima e misturados). Quando os astrócitos atingir cerca de 90% de confluência, agite o frasco para remover as células gliais contaminantes: Retirar o balão da incubadora e aperte a tampa (fenólica) ou cubra a porta (filtrado). Para remover a microglia, Agitar o frasco sobre uma plataforma orbital a 180 rpm durante 1 h. Aspirar o meio. Lavar uma vez com 5 mL de pré-aquecido meio de cultura, aspirado e substituir com 12 mL de meio de cultura. Removeros oligodendrócitos, devolver o balão para a plataforma orbital e agitar a 250 rpm, 37 ° C durante um mínimo de 7 horas, mas de preferência O / N. Aspirar o meio. Lavar uma vez com 5 mL de pré-aquecido meio de cultura, aspirado e substituir com 12 mL de meio de cultura. Devolver o frasco para a incubadora. Quando 100% confluentes, dividir os astrócitos, utilizando procedimentos padrão, na proporção de 1: 3 a 1: 2 com ácido etilenodiaminotetra-tripsina a 0,05% (EDTA). Um frasco T75 em 100% de confluência, normalmente rendimento de cerca de 4,0 X 10 6 células no total. Sob este esquema, as culturas geralmente pode ser dividido uma vez por semana. Nota: Quando o astrócitos atingem a confluência, podem ser recolhidos e utilizados para a diferenciação hiPSC como descrito abaixo no passo protocolo 3.4. Os astrócitos podem ser divididos pelo menos uma vez sem uma perda notável de viabilidade. Eles podem ser mantidos durante até 2 meses em cultura. A partir da experiência, principal embrionária dia 18 de astrócitos de rato progressively se tornar terminalmente diferenciadas e / ou perder a viabilidade após a divisão repetida. Embora seja possível congelar os astrócitos para uso futuro, prefere-se isolar os astrócitos do cérebro embrionárias fresco quando necessário. 2. Geração de rtTA / NGN2 -positivo hiPSCs NOTA: Os hiPSCs utilizados para nossos experimentos foram gerados in-house por transdução lentiviral de fibroblastos humanos com a reprogramação fatores cMyc, SOX2, OCT4 e KLF4. NOTA: Para a geração de rtTA / NGN2 hiPSCs -positivas, vectores lentivirais são usados para integrar estavelmente os transgenes no genoma das hiPSCs. O protocolo para a produção do lentivírus foi publicada previamente 22. Os detalhes dos vectores lentivirais de embalagem que são utilizados para produzir as partículas de lentivírus rtTA NGN2 e são fornecidos na <strong> Tabela de materiais / equipamentos. O vector de transferência usado para o lentivírus rtTA é pLVX-EF1α- (Tet-On-Avançada) -IRES-G418 (R); ou seja, este vector codifica um transactivador Tet-On avançada sob controlo de um promotor constitutivo EF1α e confere resistência ao antibiótico G418. O vector de transferência usado para o lentivírus NGN2 é pLVX- (TRE-thight) – (RATO) NGN2-PGK-puromicina (R); ou seja, este vector codifica o gene para neurogenin-2 murino sob o controlo de um promotor controlado por Tet e o gene de resistência à puromicina sob o controlo de um promotor constitutivo de PGK. Assim, utilizando estes dois vectores de transferência, uma linha hiPSC pode ser criado para o qual a expressão de neurogenin-2 de murino pode ser induzida por suplementação do meio com doxiciclina. Para a transdução dos hiPSCs, o sobrenadante com as partículas de lentivírus é usado (referido como "suspensão lentivírus 'no restante do texto), isto é, saberHout concentrar as partículas utilizando ultracentrifugação. Placa os hiPSCs (dia 1) NOTA: Os volumes que são mencionados neste protocolo assumem que as hiPSCs são cultivadas numa placa de 6 poços e que as células de um poço são colhidas. Além disso, presume-se que as células são plaqueadas subsequentemente em 12 cavidades de uma placa de 12 poços. Preparar 10 ml de DMEM frio / F12 com 1% (v / v) de membrana basal da matriz (BMM) para se obter BMM diluído. Adicionar 800 mL de BMM diluída por poço de uma placa de 12 poços. Incuba-se durante pelo menos 1 h em atmosfera humidificada a 37 ° C incubadora com uma atmosfera de 5% de CO 2. Antes da utilização, incubar a placa durante 1 h à TA. Meio Essencial quente 15 ml 8 (E8) com 1% (v / v) de penicilina / estreptomicina, 9 ml de DMEM / F12 e uma solução de separação celular mL (CDS) para a temperatura ambiente. Suplementar o meio E8 com a proteína quinase Rho-associado inibidor (rock). Aspirar o meio gasto das hiPSCs umd adicionar 1 mL de CDS para os hiPSCs. Incubar 3-5 min numa atmosfera humidificada de 37 ° C incubadora com uma atmosfera de 5% de CO 2. Verificar se ao microscópio as células são separar um do outro. Adicionar 2 ml de DMEM / F12 no poço, suavemente suspender as células com uma pipeta de 1000 mL e transferência das células para um tubo de 15 mL. Adicionar 7 ml de DMEM / F12 para a suspensão de células. Rodar as células a 200 xg durante 5 min. Aspirar o sobrenadante e adicionar 2 mL do meio E8 preparado. Se obter uma suspensão de células em que os hiPSCs são dissociados (não formam aglomerados de células), colocando a ponta de uma pipeta de 1000 mL de encontro ao lado do tubo de 15 mL e ressuspensão das células suavemente. Verificar sob o microscópio se as células são dissociadas. Determinar o número de células (células / mL) utilizando uma câmara de hemocitómetro. NOTA: Uma placa de 6 poços bem a 80 – 90% de confluência, normalmente obtendo-se 3,0 – 4,0 x 10 6 células no total. Aspiraro BMM diluído a partir das cavidades da placa de 12 poços. Dilui-se as células para se obter uma suspensão de células de 3,0 x 10 4 células / ml. Placa 1 mL da suspensão de células por poço da placa de 12 poços. Colocar a placa de 12 poços O / N numa atmosfera humidificada a 37 ° C incubadora com uma atmosfera de 5% de CO 2. Transdução as células iPS com rtTA e NGN2 lentivírus (dia 2) 12 mL de meio E8 morna com 1% (v / v), penicilina / estreptomicina até à temperatura ambiente. Suplementar o meio com E8 inibidor de ROCK e polibreno a uma concentração final de 8 ug / mL para a forma E8. Descongelar as alíquotas com suspensão lentivírus. Adicionar polibreno a uma concentração final de 8 ug / mL para a suspensão lentivírus. Aspirar o meio gasto e adicionar 1 mL do meio E8 preparado a cada poço. Realizar a transdução com diferentes quantidades do rtTA – e suspensões NGN2 -lentivirus. Por exemplo, transduCE O hiPSCs pela adição de 100 ul de ambas as -lentivirus rtTA e suspensão -lentivirus NGN2 a um poço da placa de 12 poços. Para os outros poços, utilizar 200 ul, 300 ul, 400 ul e 500 ul de suspensão de lentivírus, em vez de 100 uL. Os hiPSCs de dois dos poços da placa de 12 poços não deve ser transduzidas; eles vão servir como controles durante a seleção. NOTA: As transduções são de preferência realizadas em duplicado, de modo que a eficiência de transdução pode ser estimado com maior precisão depois de o início da selecção (ver passo protocolo 2.2.4). A quantidade de suspensão de lentivírus que é necessário para transduzir eficientemente a maior parte dos hiPSCs depende do título da suspensão lentivírus e a linha hiPSC que é usado. Neste estudo, nós usamos geralmente 100 – 500 mL de suspensão de lentivírus para transduzir as hiPSCs. Colocar a placa de 12 poços numa atmosfera humidificada a 37 ° C incubadora com uma atmosfera de 5% de CO2 durante 6 h. Antes do fim do período de incubação de 6 horas, o meio quente 12 mL E8 com 1% (v / v) de penicilina / estreptomicina e 12 ml de Dulbecco fosfato-salino tamponado (DPBS) à TA. Suplementar o meio E8 com inibidor de ROCK. Aspirar o meio E8 gasto. Lavar cada poço com 1 mL de DPBS. Adicionar 1 mL do meio E8 preparado a cada poço. Colocar a placa de 12 poços O / N numa atmosfera humidificada a 37 ° C incubadora com uma atmosfera de 5% de CO 2. Refrescar o meio E8 (dia 3) 12 mL de meio E8 morna com 1% (v / v), penicilina / estreptomicina até à TA. Aspirar o meio consumido a partir dos poços da placa de 12 poços e adicionar 1 mL do meio E8 preparado a cada poço. Colocar a placa de 12 poços O / N numa atmosfera humidificada a 37 ° C incubadora com uma atmosfera de 5% de CO 2. Realizar a seleção com puromicina e G418 (dia 4-8) NOTA: Dependendo da taxa de divisão celular do quadrilA linha SC e a eficiência da transdução de lentivírus, as células podem chegar a 70-80% de confluência, durante o período de selecção, no ponto em que as culturas precisam ser divididas. Uma vez que o momento do desdobramento não pode ser prevista em avanço, não será mencionado no protocolo. No entanto, em vez de refrescar o meio suplementado com E8 as concentrações mencionadas de puromicina e G418, pode-se dividir a cultura hiPSC como uma cultura normais hiPSC (incluindo plaqueamento das células em placas revestidas com vitronectina). A única exceção é que o meio E8 deve ser complementada com as concentrações mencionadas dos antibióticos para continuar a seleção. 12 mL de meio E8 morna com 1% (v / v), penicilina / estreptomicina até à temperatura ambiente. Adicionar puromicina e G418 para selecção; quantidades diferentes dos antibióticos são adicionados durante o período de selecção (Tabela 1). Estimar a eficiência da transdução calculando a percentagem de G418- e puromicinacélulas resistentes ao. Para estimar a percentagem de células resistentes, uma estimativa da percentagem de células mortas (células não resistentes) para as diferentes condições (as culturas transduzidas com as diferentes quantidades de suspensão lentivírus) e para as células nontransduced (as células que servem como um controlo de selecção). Calcula-se a percentagem de células resistentes quanto [100% – (percentagem de células mortas)]. NOTA: Se as transduções com as diferentes quantidades de suspensão lentivírus foram realizadas em duplicado, a eficácia de transdução pode ser estimado com maior precisão. A condição com as células não transduzidas serve como um controlo de selecção; as percentagens de células mortas para as culturas transduzidas com as diferentes quantidades de suspensão deve ser menor do lentivírus. A percentagem estimada de células resistentes é utilizado para escolher as que são susceptíveis hiPSCs positivo para ambos os transgenes. Em geral, nós escolhemos as hiPSCs a partir da condição de transdução foram> 90% da células sobreviver ao período de seleção 5 d. Aspirar o meio gasto das hiPSCs e adicionar 1 mL do meio E8 preparado para os poços. Colocar a placa de 12 poços O / N numa atmosfera humidificada a 37 ° C incubadora com uma atmosfera de 5% de CO 2. A concentração final de G418 A concentração final de puromicina dia 4 250 ug / mL 2 ug / mL dia 5 250 ug / mL 2 ug / mL dia 6 250 ug / mL 1 ug / mL dia 7 250 ug / mL 1 ug / mL dia 8 250 ug / mL 1 ug / mL Tabela 1: concentrações de antibióticos durante o período de seleção. </strong> As concentrações da puromicina e G418 durante o 5 d o período de selecção. Pare a seleção e iniciar a cultura regulares (dia 9 e posterior) Após o período de selecção 5 d, a cultura das hiPSCs -positivas rtTA / NGN2 como hiPSCs normais, com a excepção de que a forma E8 das células é suplementado com G418 para uma concentração final de 50 ug / mL e com puromicina a uma concentração final de 0,5? g / mL. NOTA: As células podem agora ser congelado (de acordo com protocolos convencionais para a criopreservação de células) para servir como uma reserva. Este é um passo importante para a reprodutibilidade do protocolo de diferenciação, uma vez que permite a utilização do mesmo lote de rtTA / NGN2 hiPSCs -positivas para muitas experiências futuras de diferenciação. 3. Diferenciação de rtTA / NGN2 hiPSCs -positivas aos neurônios em 6 poçosAAM e lamelas de vidro NOTA: Neste protocolo, os detalhes são fornecidos para diferenciar rtTA / NGN2 hiPSCs -positivas em dois diferentes substratos, ou seja AMA 6 poços (dispositivos compostos por 6 poços independentes com 9 gravação e 1 de referência microeletrodos incorporados por poço) e lamelas de vidro em os poços de uma placa de 24 poços. Os protocolos, contudo, podem ser facilmente adaptados para substratos maiores (por exemplo, para os poços de placas de 12 ou 6 cavidades), dimensionando-se os valores mencionados de acordo com a área da superfície. Prepare os AAM ou lamelas de vidro (dia 0 e no dia 1) O dia antes do início da diferenciação, esterilizar os MEAs de acordo com a recomendação do fabricante. Dilui-se a proteína de adesão de poli-L-ornitina (PLO) em água ultrapura esterilizada até uma concentração final de 50 ug / mL. Cubra a área de eletrodo ativo da AAM de 6 poços, colocando um 100 Lqueda da OLP diluído em cada poço. Coloque as lamelas nos poços da placa de 24 poços usando pinças estéreis. Adicionar 800 ul da PLO diluído em cada poço. Impedir que as lamelas de flutuar, empurrando-os para baixo com a ponta da pipeta 1000 mL. Incubar as MEAs de 6 poços e 24 bem placa S / N numa atmosfera humidificada a 37 ° C incubadora com uma atmosfera de 5% de CO 2. No dia seguinte, aspirar o PLO diluída. Lave as superfícies de vidro dos MEAs de 6 poços e as lamelas duas vezes com água ultrapura estéril. Diluir laminina em frio DMEM / F12 a uma concentração final de 20 ug / mL (para as MEAs de 6 poços) e 10 ug / mL (para as lamelas de vidro). Imediatamente revestir a área do eléctrodo activo de MEAs de 6 poços, colocando uma gota 100 uL em cada poço. Da mesma forma, adicionar 400 uL da laminina diluído em cada poço da placa de 24 poços para revestir as lamelas. Impedir que as lamelas de flutuar, empurrando-os para baixo com a ponta da pipeta de 1000 mL. Incubar as MEAs de 6 poços e placa de 24 poços numa atmosfera humidificada a 37 ° C incubadora com uma atmosfera de 5% de CO 2 durante pelo menos 2 h. Placa os hiPSCs (dia 1) NOTA: Os volumes que são mencionadas nos passos 3.2.1 – 3.2.4 assumir que os hiPSCs -positivas rtTA / NGN2 são cultivadas numa placa de 6 poços e que as células de um poço são colhidas. Os volumes que são necessários para o plaqueamento das células sobre as MEAs de 6 poços e / ou as lamelas depende do número de AAM de 6 poços e / ou o número de lamelas que são utilizadas na experiência; os números especificados nas etapas 3.2.6 – 3.2.8 permitem dimensionar a diferentes tamanhos de experiência. Aqueça DMEM / F12, CDS e forma E8 com 1% (v / v) de penicilina / estreptomicina a R / T. Adicionar doxiciclina para uma concentração final de 4 ug / mL e inibidor ROCHA para a forma E8. Aspirar o meio gasto dos hiPSCs -positivas rtTA / NGN2 e adicionar 1 mL CDS aos hiPSCs. Incubar 3-5 min numa atmosfera humidificada de 37 ° C incubadora com uma atmosfera de 5% de CO 2. Verificar se ao microscópio as células são separar um do outro. Adicionar 2 ml de DMEM / F12 no poço, suavemente suspender as células com uma pipeta de 1000 mL e transferência das células para um tubo de 15 mL. Adicionar 7 ml de DMEM / F12 para a suspensão de células. Rodar as células a 200 xg durante 5 min. Aspirar o sobrenadante e adicionar 2 mL do meio E8 preparado. Dissociar a hiPSCs, colocando a ponta de uma pipeta de 1000 mL de encontro ao lado do tubo de 15 mL e ressuspensão das células suavemente. Verificar sob o microscópio se as células são dissociadas. Determinar o número de células (células / mL) utilizando uma câmara de hemocitómetro. NOTA: Uma placa de 6 poços bem a 80 – 90% de confluência irá tipicamente produzir 3,0 – 4,0 x 10 6 células no total. Aspirar a laminina diluída. Para as MEAs de 6 poços, diluir as células para se obter um cesuspensão ll de 7,5 x 10 5 células / mL. Placa as células por adição de uma gota de 100 mL da suspensão de células sobre a área do eléctrodo activo, em cada poço de MEAs de 6 poços. Para as lamelas, diluir as células para se obter uma suspensão de células de 4,0 x 10 4 células / ml. Placa as células por adição de 500 uL da suspensão de células para os poços da placa de 24 poços. NOTA: A densidade celular final sobre as MEAs é mais elevada do que nas lamelas (Figura 1A e B). Descobrimos que esta alta densidade celular foi necessário para a gravação adequada da atividade da rede. No protocolo, os números são, desde que acabou por ser ideal para os ensaios. Coloque as MEAs de 6 poços e placa de 24 poços numa atmosfera humidificada a 37 ° C incubadora com uma atmosfera de 5% de CO 2 durante 2 h (MEA) ou O / N (placa de 24 poços). Após 2 h, adicionar cuidadosamente 500 ul do meio E8 preparado a cada poço das AAM de 6 poços. Coloque a 6 nósLL AAM O / N numa atmosfera humidificada a 37 ° C incubadora com uma atmosfera de 5% de CO 2. Alterar o meio (dia 2) No dia seguinte, preparar DMEM / F12 com 1% (v / v) suplemento N-2, 1% (v / v) de aminoácidos não essenciais e 1% (v / v) de penicilina / estreptomicina. Adicionar humana recombinante neurotrofina-3 (NT-3) a uma concentração final de 10 ng / mL, o factor derivado do cérebro humano recombinante neurotrófico (BDNF) a uma concentração final de 10 ng / mL, e doxiciclina para uma concentração final de 4 ug / mL. Aquecer o meio a 37 ° C. Adicionar laminina a uma concentração final de 0,2 ug / ml para o meio. Filtra-se o meio resultante. Aspirar o meio consumido a partir dos poços de MEAs de 6 poços e a placa de 24 poços e substituí-lo com a forma preparada. Incubar as MEAs de 6 poços e 24 bem placa S / N numa atmosfera humidificada a 37 ° C incubadora com uma atmosfera de 5% de CO 2. Adicionar astrócitos de rato (dia 3) <br/> NOTA: Os volumes que são mencionados neste protocolo assumem que os astrócitos de rato são cultivadas em frascos de cultura T75. É crítico que os astrócitos de rato que são adicionadas às culturas são de boa qualidade. Utilizamos dois critérios para verificar se os astrócitos de rato são de boa qualidade. Em primeiro lugar, a cultura de astrócitos de rato deve ser capaz de crescer confluente dentro de dez dias após o isolamento a partir de cérebros embrionários de rato. Em segundo lugar, depois de dividir a cultura de astrócitos de rato, os astrócitos de rato deve ser capaz de formar um confluentes, tesselada monocamada (Figura 1C). Se a cultura de astrócitos de rato não cumpre estes dois critérios, aconselhamos a não utilizar esta cultura para experimentos de diferenciação. Quente 0,05% de tripsina-EDTA à temperatura ambiente. Aquecer a DPBS e DMEM / F12 com 1% (v / v) de penicilina / estreptomicina a 37 ° C. Aspirar o meio gasto da cultura de astrócitos de rato. Lave a cultura através da adição de 5 mL de DPBS e swish ao redor delicadamente. ASPIRcomeu o DPBS e adicionar 5 mL de 0,05% de tripsina-EDTA. Swish a tripsina-EDTA em torno gentilmente. Incubar numa atmosfera humidificada a 37 ° C incubadora com uma atmosfera de 5% de CO 2 durante 5 – 10 min. Verifique sob o microscópio se as células são separadas. Retire as últimas células por bater o balão algumas vezes. Adicionar 5 mL de DMEM / F12 para o balão. Tritura-se as células cuidadosamente dentro do frasco com uma pipeta de 10 mL. Recolha a suspensão celular num tubo de 15 mL. Girar o tubo a 200 xg durante 8 min. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em 1 mL de DMEM / F12. Determinar o número de células (células / mL) utilizando uma câmara de hemocitómetro. Adicionar 7,5 x 10 4 por po de astrócitos as MEAs de 6 poços. Adicionar 2,0 x 10 4 astrócitos por poço da placa de 24 poços. Incubar as MEAs e a placa de 24 cavidades O / N numa atmosfera humidificada a 37 ° C incubadora com uma atmosfera de 5% de CO 2. Alterar o meio (dia 4) <li> Preparar meio Neurobasal com 2% (v / v) de B-27, suplemento, 1% (v / v) de L-alanil-L-glutamina e 1% (v / v) de penicilina / estreptomicina. Adicionar NT-3 a uma concentração final de 10 ng / mL, o BDNF a uma concentração final de 10 ng / mL, e doxiciclina para uma concentração final de 4 ug / mL. Além disso, adicionar citosina β-D-arabinofuranósido a uma concentração de 2 uM. NOTA: Citosina β-D-arabinofuranósido é adicionado ao meio para inibir a proliferação dos astrócitos e para matar os restantes hiPSCs que não são se diferenciar em neurónios. Filtrar a médio e quente a 37 ° C. Aspirar o meio consumido a partir dos poços de MEAs de 6 poços e a placa de 24 poços e substituí-lo com a forma preparada. Manter as MEAs de 6 poços e a placa de 24 poços numa atmosfera humidificada a 37 ° C incubadora com uma atmosfera de 5% de CO 2. Refrescar o meio (dia 6-28) NOTA: A partir do dia 6, atualizar metadedo meio a cada dois dias. A partir do dia 10 em diante, o meio é suplementado com FBS para suportar a viabilidade dos astrócitos. Prepare meio Neurobasal com 2% (v / v) de B-27, suplemento, 1% (v / v) de L-alanil-L-glutamina e 1% (v / v) de penicilina / estreptomicina. Adicionar NT-3 a uma concentração final de 10 ng / mL, o BDNF a uma concentração final de 10 ng / mL, e doxiciclina para uma concentração final de 4 ug / mL. A partir do dia 10 em diante, também suplementar o meio com 2,5% (v / v) de FBS. Filtra-se o meio resultante e aquecido a 37 ° C. Remover metade do meio gasto a partir dos poços de MEAs de 6 poços e a placa de 24 poços utilizando uma pipeta de 1000 mL e substituí-lo com a forma preparada. Manter as MEAs de 6 poços e a placa de 24 poços numa atmosfera humidificada a 37 ° C incubadora com uma atmosfera de 5% de CO 2. 4. Estabelecer o perfil neurofisiológica de Neurônios hiPSC derivadas NOTA: Duas a três semanas após a emdução de diferenciação, os neurónios hiPSC-derivados pode ser usada para diferentes análises a jusante. Nesta secção, exemplos de algumas análises são dados a jusante que pode ser realizado para estabelecer o perfil neurofisiológicos dos neurónios hiPSC-derivados. Caracterizar a atividade de rede neuronal usando AAM Ficha 20 min de atividade eletrofisiológica de neurônios hiPSC derivados cultivadas na AAM. Durante a gravação, manter a temperatura a 37 ° C, e evitar a evaporação e pH mudanças do meio de insuflação de um fluxo constante e lento de gás humidificada (5% de CO2, 20% O2, 75% N2) para o MEA . Depois de 1200X de amplificação (MEA 1060, MCS), a amostragem do sinal a 10 kHz usando o cartão de aquisição de dados MCS. Analisar os dados (pico e detecção estourar) usando um pacote de software personalizado 23. Caracterizar a atividade eletrofisiológica de uma única célula </strong> Transferir as lamelas contendo as culturas neuronais hiPSC derivados para a câmara de gravação de platina fixa submersa em um microscópio vertical. Ficha 20 min da evocadas por potenciais de ação espontânea correntes pós-sináptico (sEPSC) 24. Detectar o evento sináptica usando o programa de neurociência. Caracterizar a morfologia neuronal e expressão de sinapsina Fix e manchar os neurônios hiPSC-derivados para MAP2, sinapsina-1/2 e PSD-95 22, 24, 25. Quantificar o número de sinapsina-1/2 e PSD-95 pontos lacrimais usando software de análise de imagem.