Measurement of Particle Size Distribution in Turbid Solutions by Dynamic Light Scattering Microscopy

Takashi Hiroi; Mitsuhiro Shibayama

doi:10.3791/54885

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Chemistry

Mesure de la distribution granulométrique en turbides Solutions par Dynamic Light Scattering Microscopie

Published: January 09, 2017

doi:

10.3791/54885

Takashi Hiroi¹, Mitsuhiro Shibayama²

¹Department of Chemistry, School of Science,University of Tokyo, ²Institute for Solid State Physics,University of Tokyo

Summary

Un protocole pour la mesure directe de la distribution des tailles des particules dans des solutions concentrées en utilisant la microscopie de diffusion dynamique de la lumière est présenté.

Abstract

A protocol for measuring polydispersity of concentrated polymer solutions using dynamic light scattering is described. Dynamic light scattering is a technique used to measure the size distribution of polymer solutions or colloidal particles. Although this technique is widely used for the assessment of polymer solutions, it is difficult to measure the particle size in concentrated solutions due to the multiple scattering effect or strong light absorption. Therefore, the concentrated solutions should be diluted before measurement. Implementation of the confocal optical component in a dynamic light scattering microscope¹ helps to overcome this barrier. Using such a microscopic system, both transparent and turbid systems can be analyzed under the same experimental setup without a dilution. As a representative example, a size distribution measurement of a temperature-responsive polymer solution was performed. The sizes of the polymer chains in an aqueous solution were several tens of nanometers at a temperature below the lower critical solution temperature (LCST). In contrast, the sizes increased to more than 1.0 µm when above the LCST. This result is consistent with the observation that the solution turned turbid above the LCST.

Introduction

Particle size is one of the most fundamental properties of colloidal and polymer solutions. Numerous techniques are used to measure the particle size. Particle sizes of 1.0 µm or larger can be measured directly using an optical microscope. For smaller particles, alternative techniques, such as laser diffraction, electron microscopy, or atomic force microscopy, are used^2,3. Dynamic light scattering is a commonly-used technique for the measurement of particle size distributions in solutions⁴. The results obtained using this technique are not derived from images of the particles but from the characteristic time of the fluctuations in scattered light intensity. These fluctuations originate from Brownian motion, which is characterized by a diffusion constant. The size distribution is obtained from the distribution of diffusion constants using the Einstein-Stokes equation. Due to its simplicity, dynamic light scattering is widely used for the routine assessment of solutions, such as paints and food colloids.

Pretreatment is required for most of the techniques used for the particle size measurement of solution samples. In the case of electron microscopy and atomic force microscopy, the sample must be analyzed under vacuum conditions. Therefore, it is difficult to observe the samples in their native forms. Furthermore, for laser diffraction and dynamic light scattering, only diluted samples that are free from multiple scattering and light absorption can be measured. To overcome this difficulty, several new techniques have been proposed for the measurement of dynamic light scattering from undiluted, concentrated solutions, such as cross-correlation spectroscopy^5,6, low-coherence dynamic light scattering^7,8, diffusing-wave spectroscopy^9,10, and differential dynamic microscopy^11,12.

We have developed a new apparatus called a dynamic light scattering microscope¹. This apparatus enables us to measure turbid samples without dilution by means of a confocal optical system in which multiple scattering is eliminated using a pinhole. However, the measurement procedure and data analysis are slightly more complicated than those of commercially-available instruments. This video explains the measurement procedure and data analysis in detail using the analysis of the temperature-responsive polymer, poly(N-isopropylacrylamide), as an example.

Protocol

Préparation 1. Echantillon La purification de monomères sensibles à la température Dissoudre 20 g de N -isopropylacrylamide (NIPA) dans 100 ml de toluène. Filtrer la solution sous vide pour éliminer la poussière. Mélanger le filtrat avec 500 ml d'éther de pétrole. Placer le récipient réactionnel dans un bain d'eau glacée. Agiter la solution jusqu'à ce que les monomères sont précipités (généralement 30 minutes). Filtrer la solution sous aspiration pour obtenir les monomères précipitées. Sécher les monomères sous pression réduite (100 Pa) pendant la nuit. Préparation de la solution de polymère sensible à la température Dégazer 20 mL d'eau déminéralisée pendant 1,0 min en utilisant une pompe à membrane. Dissoudre 780,8 mg du PNIA purifié dans 9,5 ml d'eau dégazée et désionisée. Placer le récipient réactionnel dans un bain d'eau glacée. Bouclier de la réaction dela lumière en recouvrant l'appareil avec du papier d'aluminium. Agiter la solution doucement pendant 10 min tout en introduisant un flux modéré de gaz Ar doucement par une pointe de pipette attachée à la bouteille de gaz avec un tube. Ajouter 11,9 ul de N, N, N ', N' -tétraméthyléthylènediamine à la solution via une micropipette. Agiter la solution pendant 1,0 min, tout en introduisant du gaz Ar, tel que mentionné à l'étape 1.2.5. Tout en agitant l'échantillon, on dissout 4,0 mg de persulfate d'ammonium dans 0,5 ml d'eau dégazée et déionisée. Mélanger la solution d'échantillon (étape 1.2.7) et une solution de persulfate d'ammonium (étape 1.2.8). Agiter la solution pendant 30 s, tout en introduisant du gaz Ar, tel que mentionné à l'étape 1.2.5. Couvrir la solution avec du papier d'aluminium et de le conserver au réfrigérateur (4 ° C) pendant la nuit. Préparation des supports d'échantillons Placer 60 ul de la solution d'échantillon (à partir deétape 1.2.11) dans une glissière de la cavité. Couvrir la solution avec un couvercle en verre circulaire. Veillez à ne pas les bulles d'air de piège. Retirer l'excès de solution à l'aide d'une micropipette et de laboratoire lingettes. Sceller l'échantillon avec de la colle. Laisser sécher la colle à la température ambiante (typiquement 6 h). Préparer une autre lame remplie de 0,1% en poids de latex de polystyrène (diamètre de particule de 100 nm) de suspension en suivant les étapes 1.3.1-1.3.4. Cette diapositive est utilisée comme standard. 2. Mesure des particules de taille avec un microscope Scattering Dynamic Light Optimisation de l'instrument Placer la lame de suspension de latex de polystyrène (étape 1.3.5) sur la platine du microscope inversé. Le côté du verre de couverture doit faire face vers le bas. Placer un amortisseur de faisceau devant le détecteur (une photodiode à avalanche et d'un autocorrélateur). Appliquer un faisceau laser (laser à l'état solide, λ = 488 nm, 30 mW, continueonde) à l'échantillon à travers un objectif (10 ×). Une partie de la lumière réfléchie passe par un miroir de lancement du microscope et est observée par une caméra CCD montée à l'orifice latéral du microscope (Figure 1). Réglez la hauteur de lentille d'objectif pour régler le point focal à la suspension de l'échantillon en déplaçant la hauteur de lentille de l'objectif de la position basse à élevée. Au cours de cette procédure, l'image réfléchie est focalisée à trois reprises, à la surface du couvercle en verre, à l'interface entre le verre de protection et l'échantillon, et à l'interface entre l'échantillon et le verre de trous glissière. Réglez le point focal entre les deuxième et troisième points. Atténuer l'intensité de la lumière diffusée en modifiant la puissance du laser. Introduire la lumière diffusée dans le détecteur en supprimant l'amortisseur de faisceau devant le détecteur. Cette unité mesure la corrélation temporelle de l'intensité lumineuse. Définir un sténopé (φ = 50 pm) entreen le microscope et le détecteur pour obtenir l'effet confocale. Ajuster la position du trou d'épingle afin de maximiser l'intensité de la lumière au niveau du détecteur. Mesurer la fonction de corrélation temporelle de l'intensité de la lumière diffusée pendant 30 secondes en initiant l'opération de corrélateur par l'intermédiaire d'un ordinateur. La fonction de corrélation mesurée est souvent exprimée en g (2) (t) – 1, où t est le temps de corrélation et 4 . Ici, I (t) est l'intensité de la lumière diffusée à l'instant t et (•••) T est la moyenne de temps. Le temps de décroissance sera d'environ 0,1 ms. Réglez le point focal pour obtenir une large gamme pour l'amplitude initiale de la fonction de corrélation temporelle (g (2) (t = 0) – 1). NOTE: L'amplitude initiale est fortement affectée par la quantité de lumière réfléchie. En déplaçant le point focal de remorquageard l'interface entre le verre de protection et l'échantillon, la quantité de lumière réfléchie augmente. Pour les diffuseurs de lumière forte, comme du latex de polystyrène, dont l'amplitude initiale peut être modifiée entre 0 et 1. Cependant, il est difficile de régler l'amplitude initiale proche de 1 pour les solutions de polymères les plus courants, car l'intensité de la lumière réfléchie est beaucoup plus élevé que celle de la lumière diffusée. Appliquer la transformation de Laplace inverse ( en utilisant le programme de régularisation contraint CONTIN 13,14) à la fonction de corrélation temporelle obtenue pour obtenir la fonction de distribution de taille. Dans les cas où l'amplitude initiale est fixée à moins de 0,2, la fonction de distribution du rayon hydrodynamique montrera un pic pointu autour de 100 nm, ce qui est deux fois le rayon réel (voir la discussion pour plus de détails). Mesure de l' échantillon Réglez la température de l'étape à 25 ° C. Placez une diapositive préparée avec poly-PNIA (PNIPA) solution (étape 1.3.4) sur la platine du microscope. Mesurer la fonction de corrélation temporelle de l'intensité de la lumière diffusée en suivant les étapes 2.1.4-2.1.8. Si l'amplitude initiale est supérieure à 0,2, ajuster le point focal pour rendre l'amplitude initiale de la fonction de corrélation temporelle inférieure à 0,2 en suivant l'étape 2.1.9. Une petite amplitude initiale simplifie l'analyse. Réglez la température de l'étape à 35 ° C et attendre jusqu'à ce que la solution devient trouble. La température de solution critique inférieure (LCST) de solution de PNIPA est de 32 ° C 15. Mesurer la fonction de corrélation temporelle par les étapes suivantes 2.1.4-2.1.8. Si possible, régler la position du point focal pour rendre l'amplitude initiale de la fonction de corrélation temporelle inférieure à 0,2. Pour les solutions turbides, leurs amplitudes initiales ont tendance à augmenter, étant donné que l'intensité de la lumière diffusée augmente, tandis que celle de la lumière réfléchie reste constante. Appliquer l'inverse de Laplace transformatisur les fonctions de corrélation temporelle obtenue pour obtenir les fonctions de distribution de taille. Notez que la taille est la moitié de la valeur obtenue dans le cas où l'amplitude initiale est inférieur à 0,2.

Representative Results

Les fonctions de temps de corrélation de l' intensité de lumière diffusée pour une suspension de latex de polystyrène (rayon des particules: 50 nm) ont été mesurés à différents points de contact, comme représenté sur la figure 2 (a). Ces fonctions de corrélation ont été transformés en les fonctions de distribution du rayon hydrodynamique par la transformation de Laplace inverse (voir figure 2 (b) et (c)). En utilisant la même procédure, les fonctions de corrélation temporelle et les fonctions de distribution du rayon hydrodynamique de la solution PNIPA ont été obtenus à 25 ° C et 35 ° C, respectivement. Figures 3 (a) et (b) montrent les fonctions de corrélation temporelle de l'intensité de la lumière diffusée et les fonctions de distribution de taille correspondantes de la solution de PNIPA ci – dessous (25 ° C) et au- dessus (35 ° C) la LCST. Les fonctions de distribution granulométrique ont été obtenus par la transformation de Laplace inverse suivie par lacorrection de la hétérodyne partielle. Le rayon hydrodynamique moyen inférieur à la LCST est de plusieurs dizaines de nanomètres, ce qui est typique pour des solutions de polymère. En revanche, le rayon hydrodynamique au-dessus de la LCST est d'environ 1,0 pm. Ce résultat est cohérent avec le fait que la solution est trouble au-dessus de la LCST. Les lignes bleues et rouges sur la figure 3 représentent la répartition granulométrique des solutions obtenues PNIPA immédiatement après et 20 minutes après que la solution devienne turbide, respectivement. La figure 3 (b) montre clairement la croissance de l'agrégat. Figure 1. Schéma du microscope dynamique de diffusion de lumière. Sténopé (PH), diviseur de faisceau (BS), polariseur (Pol), et photodiode à avalanche (APD). S'il vous plaît cliquer ici pour voirune version plus grande de cette figure. Figure 2. Les résultats représentatifs pour une suspension de latex de polystyrène. (A) fonctions temps de corrélation de l'intensité de la lumière diffusée pour la suspension de latex de polystyrène. Le rayon nominal est de 50 nm et la concentration est de 0,1% en poids. Deux ensembles de données ont été obtenues à partir de différents points de diffusion. (B), (c) les fonctions de distribution de taille correspondante de la suspension de latex de polystyrène obtenus par la transformation de Laplace inverse de (a). La ligne rouge correspond à la fonction de corrélation temporelle, dont l'amplitude initiale est d'environ 1,0, et la ligne bleue correspond à celle d'une amplitude initiale qui est d'environ 0,2. L'axe horizontal a été calculé sans (b) et (c) compte tenu de l'effet de hétérodynage partiel (PHD) lorsque A << ; 1. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 3. Les résultats représentatifs pour une solution de PNIPA. (A) les fonctions Temps de corrélation d'intensité de la lumière diffusée pour la solution de PNIPA. (B) des fonctions de distribution de dimensions correspondantes pour la solution de PNIPA obtenue par la transformation de Laplace inverse de (a). L'axe horizontal a été calculée en tenant compte de l'effet de hétérodynage partielle pour chaque ensemble de données. La ligne noire représente les données obtenues à 25 ° C. La ligne rouge représente les données obtenues juste après que la solution devienne turbide (35 ° C). La ligne bleue représente les données obtenues après une mesure de 20 min de la ligne rouge./54885/54885fig3large.jpg "Target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

L'amplitude initiale de la fonction de corrélation temporelle dépend fortement du point focal, comme représenté sur la figure 2 (a). Cela contredit apparemment le fait que la solution soit homogène ( à l' exception de la couche mince à l'interface) ^8. Cette variation de l'amplitude initiale est attribuée à une variation de la quantité de lumière réfléchie. Théorie hétérodyne partielle ¹⁶ prévoit que l'amplitude initiale, A, l'intensité de la lumière diffusée, je _s, et l'intensité de la lumière réfléchie, I _r, satisfait l'équation suivante ¹

Cette équation montre que la plus grande I _r devient plus petit A devient. Par conséquent, A est réduit en réglant la position du foyer à proximité de l'interface. La diffusion apparente D constante _A can est obtenue en ajustant la fonction de corrélation temporelle dans le cas des solutions monodisperses:

où . Ici, n est l'indice de réfraction du solvant (eau, 1,33), θ est l'angle dispersé (180 °) et λ est la longueur d' onde de la lumière (514,5 nm). Depuis , nous avons appliqué la géométrie de rétrodiffusion, la valeur de q est fixé. Toutefois, ce point est résolu en utilisant des longueurs d'onde différentes de la lumière. S'il vous plaît noter que tout type de source laser à onde continue est disponible pour construire le microscope DLS. Merci au petit volume irradié, le facteur de cohérence ¹⁷ est estimée à plus de 0,99 et est négligeable. Pour les solutions polydispersées, la fonction de distribution D _A est obtenue par la transformation de Laplace inverse. e hétérodynes partielsEory prédit aussi que D _A ne soit pas la même que la diffusion effective D constante. Ces deux constantes de diffusion satisfont à l'équation suivante:

La constante de diffusion D est converti en le rayon hydrodynamique R _h en utilisant l'équation de Stokes-Einstein ^4. Lorsque A = 1, cette relation devient D _A = D. Dans ce cas, le processus de conversion de données est le même que celui de la diffusion dynamique de la lumière commune. La ligne rouge montre la figure 2 (b) correspond à ce cas. En revanche, cette relation devient D _A D = 0,5 à la limite de A → 0. Par conséquent, la taille est estimée être deux fois plus grande que la taille réelle lorsque A est faible ( en pratique, inférieure à 0,2), comme le montre la ligne bleue de la figure 2 (b) </strong>. Si l' on sait que A est significativement plus faible, l'axe horizontal peut être déplacé, comme représenté sur la figure 2 (c). En principe, nous pouvons convertir D _A en D pour toute valeur de A. Dans la pratique, cependant, il est préférable de définir l'amplitude initiale inférieure à 0,2, puisque simple approximation D _A ~ 0,5 D est vrai.

Les traits saillants de la technique de diffusion de lumière dynamique microscope ont été démontrées en utilisant une solution de PNIPA. La conformation de PNIPA ci – dessous et au- dessus du LCST a été largement étudiée en utilisant un petit angle de diffusion de neutrons ^15,18. En revanche, la diffusion de lumière dynamique n'a pas été utilisée pour l'analyse des PNIPA au- dessus de la LCST en raison de sa turbidité ^19. Ce problème est résolu par le microscope de diffusion dynamique de la lumière, comme représenté sur les figures 3 (a) et (b). La taille de ces agrégats est plusieurs &# 181; m, qui ne peut être obtenu soit par un petit angle X-ray / diffusion des neutrons ou des techniques de diffusion de la lumière classiques. Les mesures de résolution temporelle à l'aide de ce système donnent des informations sur le processus d'agrégation au cours du changement de température.

L'inconvénient du microscope dynamique de dispersion de la lumière est également illustré sur la figure 3. Pour que le résultat ci – dessous de la LCST, la fonction de corrélation temporelle est fortement affectée par la très petite quantité de poussière présente (les lignes noires en figure 3). Par exemple, la fonction de corrélation de temps ne se dégrade pas complètement, même avec des temps de corrélation de l'ordre de 1,0 s. En effet, le volume irradié avec cet appareil (environ 1,0 um) est nettement plus faible que celle irradiée par le dispositif de diffusion de lumière dynamique habituelle (environ 100 pm). Dans le cas où l'intensité de la lumière dispersée est faible, le signal est masqué par le bruit, telle que celle causée par l'artles montants du centre commercial de la poussière dans la solution. Par conséquent, les trois pics représentés sur la figure 3 (b) peuvent ne pas avoir d' importance quantitative , bien que l'ordre général de la taille est significative. A noter qu'un tel disperseur faible peut être mesurée par un appareil classique de diffusion de lumière dynamique.

Nous avons démontré que le microscope dynamique de diffusion de la lumière nous permet de mesurer des échantillons à la fois transparents et turbides avec la même configuration. Etant donné que la longueur du trajet optique dans les échantillons est courte, cette technique peut être appliquée à des échantillons de solides absorbant la lumière, tels que des suspensions de nanotubes de carbone ^20. En outre, en raison de sa haute résolution spatiale, cette technique peut être appliquée à des cellules biologiques. Pour son application à la biologie, ce procédé peut également être combiné avec d'autres techniques d'imagerie, telles que la fluorescence et l'imagerie Raman. Ainsi, nous pensons que le microscope dynamique de diffusion de la lumière est un outil puissant pour un large éventail de domaines de recherche.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work has been financially supported by Grants-in-Aid for Scientific Research from the Ministry of Education, Culture, Sports, Science, and Technology (No. 25248027 to M.S.).

Materials

N-isopropylacrylamide, 98%	Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.	I0401
toluene, 99%	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	201-01876
petroleum ether, distillation temperature 30 ~ 60 °C	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	169-22565
N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine, 99%	Sigma	T9281
ammonium persulfate, 98%	Sigma	248614
polystyrene latex suspension, 1 wt%	Duke Scientific Corporation	3500A
argon	Koike Sanso Kogyo Co., Ltd.		purity > 99.999 vol.%

cavity slide	Matsunami Glass Ind.,Ltd.	83-0336
inverted microscope	Nikon Instech Co., Ltd.	ECLIPSE Ti-U
Thermo Plate	Tokai Hit CO.,Ltd	TP-108R-C
Ar-Kr ion laser	Spectra-Physics	Stabilite 2018
avalanche photodiode	ALV-GmbH	ALV-High Q.E. Avalanche Photo Diode
correlator	ALV-GmbH	ALV-5000/EPP

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Hiroi, T., Shibayama, M. Measurement of Particle Size Distribution in Turbid Solutions by Dynamic Light Scattering Microscopy. J. Vis. Exp. (119), e54885, doi:10.3791/54885 (2017).

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