Measurement of Particle Size Distribution in Turbid Solutions by Dynamic Light Scattering Microscopy

Takashi Hiroi; Mitsuhiro Shibayama

doi:10.3791/54885

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Chemistry

Medición de Tamaño de Partícula de distribución en turbias Soluciones por Dynamic Light Scattering Microscopía

Published: January 09, 2017

doi:

10.3791/54885

Takashi Hiroi¹, Mitsuhiro Shibayama²

¹Department of Chemistry, School of Science,University of Tokyo, ²Institute for Solid State Physics,University of Tokyo

Summary

Se presenta un protocolo para la medición directa de la distribución del tamaño de partícula en soluciones concentradas utilizando microscopía de dispersión de luz dinámica.

Abstract

A protocol for measuring polydispersity of concentrated polymer solutions using dynamic light scattering is described. Dynamic light scattering is a technique used to measure the size distribution of polymer solutions or colloidal particles. Although this technique is widely used for the assessment of polymer solutions, it is difficult to measure the particle size in concentrated solutions due to the multiple scattering effect or strong light absorption. Therefore, the concentrated solutions should be diluted before measurement. Implementation of the confocal optical component in a dynamic light scattering microscope¹ helps to overcome this barrier. Using such a microscopic system, both transparent and turbid systems can be analyzed under the same experimental setup without a dilution. As a representative example, a size distribution measurement of a temperature-responsive polymer solution was performed. The sizes of the polymer chains in an aqueous solution were several tens of nanometers at a temperature below the lower critical solution temperature (LCST). In contrast, the sizes increased to more than 1.0 µm when above the LCST. This result is consistent with the observation that the solution turned turbid above the LCST.

Introduction

Particle size is one of the most fundamental properties of colloidal and polymer solutions. Numerous techniques are used to measure the particle size. Particle sizes of 1.0 µm or larger can be measured directly using an optical microscope. For smaller particles, alternative techniques, such as laser diffraction, electron microscopy, or atomic force microscopy, are used^2,3. Dynamic light scattering is a commonly-used technique for the measurement of particle size distributions in solutions⁴. The results obtained using this technique are not derived from images of the particles but from the characteristic time of the fluctuations in scattered light intensity. These fluctuations originate from Brownian motion, which is characterized by a diffusion constant. The size distribution is obtained from the distribution of diffusion constants using the Einstein-Stokes equation. Due to its simplicity, dynamic light scattering is widely used for the routine assessment of solutions, such as paints and food colloids.

Pretreatment is required for most of the techniques used for the particle size measurement of solution samples. In the case of electron microscopy and atomic force microscopy, the sample must be analyzed under vacuum conditions. Therefore, it is difficult to observe the samples in their native forms. Furthermore, for laser diffraction and dynamic light scattering, only diluted samples that are free from multiple scattering and light absorption can be measured. To overcome this difficulty, several new techniques have been proposed for the measurement of dynamic light scattering from undiluted, concentrated solutions, such as cross-correlation spectroscopy^5,6, low-coherence dynamic light scattering^7,8, diffusing-wave spectroscopy^9,10, and differential dynamic microscopy^11,12.

We have developed a new apparatus called a dynamic light scattering microscope¹. This apparatus enables us to measure turbid samples without dilution by means of a confocal optical system in which multiple scattering is eliminated using a pinhole. However, the measurement procedure and data analysis are slightly more complicated than those of commercially-available instruments. This video explains the measurement procedure and data analysis in detail using the analysis of the temperature-responsive polymer, poly(N-isopropylacrylamide), as an example.

Protocol

1. Preparación de muestras La purificación de los monómeros sensibles a la temperatura Disolver 20 g de N -isopropylacrylamide (NIPA) en 100 ml de tolueno. Se filtra la solución con succión para eliminar el polvo. Mezclar el filtrado con 500 ml de éter de petróleo. Coloque el recipiente de reacción en un baño de hielo-agua. Se agita la solución hasta que los monómeros se precipitan (típicamente 30 min). Se filtra la solución con succión para obtener los monómeros de precipitados. Secar los monómeros bajo presión reducida (100 Pa) durante la noche. Preparación de la solución de polímero sensible a la temperatura Degas 20 ml de agua desionizada durante 1,0 min usando una bomba de diafragma. Disolver 780,8 mg del ingreso y producción purificado en 9,5 ml de agua desionizada y desgasificada. Coloque el recipiente de reacción en un baño de hielo-agua. Proteger a la reacción dea la luz cubriendo el aparato con papel de aluminio. Se agita la solución suavemente durante 10 min mientras que la introducción de un flujo moderado de gas Ar suavemente a través de una punta de pipeta unida a la botella de gas con un tubo. Añadir 11,9 l de N, N, N ', N' tetrametiletilendiamina a la solución a través de una micropipeta. Se agita la solución durante 1,0 minutos, mientras que la introducción de gas Ar, tal como se menciona en el paso 1.2.5. Mientras se agita la muestra, se disuelven 4,0 mg de persulfato de amonio en 0,5 ml de agua desionizada y desgasificada. Mezclar la solución de la muestra (de la etapa 1.2.7) y la solución de persulfato de amonio (de la etapa 1.2.8). Se agita la solución durante 30 s, mientras que la introducción de gas Ar, tal como se menciona en el paso 1.2.5. Cubrir la solución con papel de aluminio y guardar en el refrigerador (4 ° C) durante la noche. Preparación de sujeciones de los modelos Colocar 60 l de la solución de muestra (depaso 1.2.11) en una diapositiva cavidad. Cubrir la solución con una cubierta de vidrio circular. Tenga cuidado de no atrapar burbujas de aire. Retire el exceso de solución con una micropipeta y de laboratorio toallitas. Sellar la muestra con pegamento. Deje que el pegamento se seque a temperatura ambiente (típicamente 6 h). Preparar otra diapositiva llena de látex de 0,1% en peso de poliestireno (diámetro de partícula de 100 nm) la suspensión siguiendo los pasos 1.3.1-1.3.4. Esta diapositiva se utiliza como un estándar. 2. Tamaño de Partícula de medición con una dispersión microscopio de luz dinámica Optimización del instrumento Colocar el portaobjetos suspensión de látex de poliestireno (de la etapa 1.3.5) en la platina del microscopio invertido. La parte cubierta de vidrio debe quedar hacia abajo. Colocar un amortiguador de haz delante del detector (un fotodiodo de avalancha y un autocorrelador). Aplicar un haz de láser (láser de estado sólido, λ = 488 nm, 30 mW, continuode onda) a la muestra a través de una lente de objetivo (10 ×). Una parte de la luz reflejada pasa a través de un espejo lanzamiento del microscopio y se observa por una cámara CCD montada en el puerto del lado del microscopio (Figura 1). Ajuste la altura de la lente del objetivo para ajustar el punto focal en la suspensión de la muestra al cambiar la altura de la lente del objetivo de la posición de baja a alta. Durante este procedimiento, la imagen reflejada se centra en tres ocasiones: en la superficie del vidrio de cubierta, en la interfaz entre el vidrio de cubierta y la muestra, y en la interfaz entre la muestra y el cristal agujero de diapositivas. Establecer el punto focal entre los puntos segundo y tercero. Atenuar la intensidad de la luz dispersada por el cambio de la potencia del láser. Introducir la luz dispersada en el detector mediante la eliminación de la compuerta de haz delante del detector. Esta unidad mide la correlación temporal de la intensidad de la luz. Establecer un agujero de alfiler (φ = 50 micras) between el microscopio y el detector para lograr el efecto confocal. Ajustar la posición del agujero de alfiler para maximizar la intensidad de la luz en el detector. Medir la función de correlación en el tiempo de la intensidad de la luz dispersada durante 30 s mediante el inicio de la operación del correlador través de un ordenador. La función de correlación se mide a menudo se expresa como g (2) (t) – 1, donde t es el tiempo de correlación y 4 . Aquí, I (t) es la intensidad de la luz dispersada en el momento t, y (•••) T es un promedio de tiempo. El tiempo de caída será de aproximadamente 0,1 ms. Ajustar el punto focal para obtener una amplia gama para la amplitud inicial de la función de correlación en el tiempo (g (2) (t = 0) – 1). NOTA: La amplitud inicial es fuertemente afectada por la cantidad de luz reflejada. Moviendo el punto focal de remolqueARD El interfaz entre el vidrio de cubierta y la muestra, aumenta la cantidad de luz reflejada. Para fuertes dispersores de luz, tales como látex de poliestireno, la amplitud inicial puede ser alterada de 0 a 1. Sin embargo, es difícil establecer la amplitud inicial cerca de 1 para las soluciones de polímero más comunes porque la intensidad de la luz reflejada es mucho mayor que la de la luz dispersada. Aplicar la inversa de Laplace de transformación (mediante el programa de regularización limitado CONTIN 13,14) a la función de correlación en el tiempo obtenido para adquirir la función de distribución de tamaño. En los casos en que la amplitud inicial se establece en menos de 0,2, la función de distribución de la radio hidrodinámico mostrará un fuerte pico alrededor de 100 nm, que es dos veces el radio real (véase la discusión para más detalles). medición de la muestra Ajuste la temperatura de la etapa a 25 ° C. Coloque una diapositiva preparada con poli-ingreso y producción solut (PNIPA)ion (etapa 1.3.4) en la platina del microscopio. Medir la función de correlación en el tiempo de la intensidad de la luz dispersada por los siguientes pasos 2.1.4-2.1.8. Si la amplitud inicial es mayor que 0,2, ajustar el punto focal para que la amplitud inicial de la función de correlación de tiempo inferior a 0,2 siguiendo el paso 2.1.9. Una pequeña amplitud inicial simplifica el análisis. Ajuste la temperatura de la etapa a 35 ° C y espere hasta que la solución se vuelve turbia. La temperatura de solución crítica inferior (LCST) de solución PNIPA es de 32 ° C 15. Medir la función de correlación en el tiempo siguiendo los pasos 2.1.4-2.1.8. Si es posible, ajustar la posición del punto focal para hacer la amplitud inicial de la función de correlación de tiempo inferior a 0,2. Para las soluciones turbias, sus amplitudes iniciales tienden a aumentar, ya que la intensidad de los dispersos luz aumenta mientras que la de la luz reflejada se mantiene constante. Aplicar la inversa de Laplace Transformatia las funciones de correlación de tiempo obtenidos para obtener las funciones de distribución de tamaño. Tenga en cuenta que el tamaño real es la mitad del valor obtenido en el caso de que la amplitud inicial es menor que 0,2.

Representative Results

Funciones de tiempo de correlación de la intensidad de la luz dispersada para una suspensión de látex de poliestireno (radio de la partícula: 50 nm) se midieron en diferentes puntos focales, como se muestra en la Figura 2 (a). Estas funciones de correlación se convirtieron en las funciones de distribución del radio hidrodinámico por la transformación inversa de Laplace (se refieren a la figura 2 (b) y (c)). Utilizando el mismo procedimiento, las funciones de correlación de tiempo y funciones de distribución del radio hidrodinámico de la solución PNIPA se obtuvieron a 25 ° C y 35 ° C, respectivamente. Las figuras 3 (a) y (b) muestran las funciones de correlación de tiempo de la intensidad de la luz dispersada y las correspondientes funciones de distribución de tamaño de la solución por debajo de PNIPA (25 ° C) y superior (35 ° C) de la LCST. Las funciones de distribución de tamaño se obtuvieron mediante la transformación inversa de Laplace seguido de lacorrección de la heterodino parcial. El radio hidrodinámico promedio por debajo de la LCST es de varias decenas de nanómetros, lo cual es típico para las soluciones de polímero. En contraste, el radio hidrodinámico por encima de la LCST es de aproximadamente 1,0 micras. Este resultado es consistente con el hecho de que la solución está turbia por encima de la LCST. Las líneas rojas y azules en la Figura 3 representan la distribución del tamaño de las soluciones PNIPA obtiene inmediatamente después y 20 minutos después de que la solución se volvió turbia, respectivamente. La Figura 3 (b) indica claramente el crecimiento de la agregación. Figura 1. Esquema del microscopio dispersión de luz dinámica. Pinhole (PH), divisor de haz (BS), polarizador (Pol) y un fotodiodo de avalancha (APD). Haga clic aquí para veruna versión más grande de esta figura. Figura 2. Los resultados representativos para una suspensión de látex de poliestireno. (A) Tiempo de funciones de correlación de la intensidad de la luz dispersada por la suspensión de látex de poliestireno. El radio nominal es 50 nm y la concentración es 0,1% en peso. Dos conjuntos de datos se obtuvieron a partir de diferentes puntos de dispersión. (B), (c) correspondientes funciones de distribución de tamaño de la suspensión de látex de poliestireno obtenidos por la inversa de Laplace transformación de (a). La línea roja corresponde a la función de correlación en el tiempo cuya amplitud inicial es de aproximadamente 1,0, y la línea azul corresponde a la que con una amplitud inicial que es de aproximadamente 0,2. En el eje horizontal se calcula sin (b) y con (c) teniendo en cuenta el efecto de heterodino parcial (PHD) cuando A << ; 1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3. Los resultados representativos para una solución PNIPA. (A) Tiempo de funciones de correlación de la intensidad de la luz dispersada por la solución PNIPA. (B) funciones de distribución de tamaño correspondiente para la solución PNIPA obtenido por la transformación inversa de Laplace de (a). En el eje horizontal se calcula teniendo en cuenta el efecto de heterodino parcial para cada conjunto de datos. La línea de color negro representa los datos obtenidos a 25 ° C. La línea roja representa los datos obtenidos a continuación de la solución se volvió turbia (35 ° C). La línea azul representa los datos obtenidos después de una medición de 20 min de la línea roja./54885/54885fig3large.jpg "Target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

La amplitud inicial de la función de correlación de tiempo depende en gran medida del punto focal, tal como se muestra en la Figura 2 (a). Esta aparentemente contradice el hecho de que la solución es homogénea (a excepción de la capa delgada en la interfaz) ^8. Esta variación en la amplitud inicial se atribuye a una variación en la cantidad de luz reflejada. La teoría heterodino parcial ¹⁶ predice que la amplitud inicial, A, la intensidad de la luz dispersada, yo _s, y la intensidad de la luz reflejada, I _r, satisface la siguiente ecuación ¹

Esta ecuación muestra que la mayor I _r se convierte, el más pequeño se convierte en A. Por lo tanto, A se reduce en un ajuste de la posición focal cerca de la interfaz. La aparente constante de difusión D _A can obtenerse mediante el ajuste de la función de correlación en el tiempo en el caso de soluciones monodispersas:

dónde . Aquí, n es el índice de refracción del disolvente (agua, 1,33), θ es el ángulo dispersa (180 °), y λ es la longitud de onda de la luz (514,5 nm). Desde aplicamos la geometría de retrodispersión, el valor de q es fijo. Sin embargo, este punto se resuelve mediante el uso de diferentes longitudes de onda de la luz. Tenga en cuenta que cualquier tipo de fuente de láser de onda continua está disponible para construir el microscopio DLS. Gracias al pequeño volumen irradiado, el factor de coherencia ¹⁷ se estima en más de 0,99 y es insignificante. Para soluciones polidispersos, la función de distribución de D _A se obtiene por la transformación inversa de Laplace. º parciales heterodyneEory también predice que D _A no es la misma que la constante de difusión real D. Estas dos constantes de difusión satisfacen la siguiente ecuación:

La constante de difusión D se convierte en el hidrodinámico _h radio R utilizando la ecuación de Einstein-Stokes ^4. Cuando a = 1, esta relación se convierte en D _A = D. En este caso, el proceso de conversión de datos es el mismo que el de la dispersión dinámica de luz común. La línea roja muestra en la Figura 2 (b) corresponde a este caso. Por el contrario, esta relación se convierte en D _A = 0,5 D en el límite de A → 0. Por lo tanto, el tamaño se estima que es dos veces mayor que el tamaño real cuando A es pequeña (prácticamente, a menos de 0,2), como se muestra por la línea azul de la figura 2 (b) </strong>. Si se sabe que A es significativamente pequeña, el eje horizontal puede ser desplazado, como se muestra en la Figura 2 (c). En principio, se puede convertir en D _A D para cualquier valor de a. En la práctica, sin embargo, es mejor para establecer la amplitud inicial menor que 0,2, ya que la aproximación simple D _A ~ 0,5 D es cierto.

Las características destacadas de la técnica de dispersión de luz dinámica microscopio se demostró usando una solución PNIPA. La conformación de PNIPA debajo y por encima de la LCST se ha estudiado ampliamente el uso de neutrones de ángulo pequeño de dispersión ^15,18. Por el contrario, la dispersión dinámica de la luz no se ha utilizado para el análisis de PNIPA por encima de la LCST debido a su turbidez ^19. Este problema se resuelve por el microscopio dispersión de luz dinámica, como se muestra en las figuras 3 (a) y (b). El tamaño de estos agregados es de varios y# 181; m, lo que no puede obtenerse por cualquiera de pequeña rayos X de ángulo / dispersión de neutrones o técnicas de dispersión de luz convencionales. mediciones de tiempo de resolverse utilizando este sistema dan información sobre el proceso de agregación durante el cambio de temperatura.

El inconveniente del microscopio dispersión de luz dinámica también se ilustra en la Figura 3. Para el resultado por debajo de la LCST, la función de correlación en el tiempo está fuertemente afectada por la muy pequeña cantidad de polvo presente (las líneas negras en la Figura 3). Por ejemplo, la función de correlación en el tiempo no se descompone por completo, incluso con tiempos de correlación en el orden de 1,0 s. Esto se debe a que el volumen irradiado con este aparato (aproximadamente 1,0 m) es significativamente menor que la irradiada con el aparato de dispersión de luz dinámica habitual (aproximadamente 100 micras). En los casos en que la intensidad de la luz dispersada es débil, la señal es oscurecida por el ruido, como la causada por salameda cantidades de polvo en la solución. Por lo tanto, los tres picos que se muestran en la Figura 3 (b) no pueden tener importancia cuantitativa aunque el orden general de que el tamaño es significativa. Tenga en cuenta que un dispersor tan débil se puede medir mediante un aparato de dispersión dinámica de luz convencional.

Hemos demostrado que el microscopio dispersión de luz dinámica nos permite medir muestras tanto transparentes y turbios con la misma configuración. Dado que la longitud del camino óptico en las muestras es corto, esta técnica se puede aplicar a fuertes muestras absorbentes de la luz, tales como suspensiones de nanotubos de carbono ^20. Además, debido a su alta resolución espacial, esta técnica se puede aplicar a las células biológicas. Para su aplicación a la biología, este método también se puede combinar con otras técnicas de imagen, tales como la fluorescencia y formación de imágenes Raman. Por lo tanto, creemos que el microscopio dispersión de luz dinámica es una poderosa herramienta para una amplia gama de campos de investigación.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work has been financially supported by Grants-in-Aid for Scientific Research from the Ministry of Education, Culture, Sports, Science, and Technology (No. 25248027 to M.S.).

Materials

N-isopropylacrylamide, 98%	Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.	I0401
toluene, 99%	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	201-01876
petroleum ether, distillation temperature 30 ~ 60 °C	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	169-22565
N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine, 99%	Sigma	T9281
ammonium persulfate, 98%	Sigma	248614
polystyrene latex suspension, 1 wt%	Duke Scientific Corporation	3500A
argon	Koike Sanso Kogyo Co., Ltd.		purity > 99.999 vol.%

cavity slide	Matsunami Glass Ind.,Ltd.	83-0336
inverted microscope	Nikon Instech Co., Ltd.	ECLIPSE Ti-U
Thermo Plate	Tokai Hit CO.,Ltd	TP-108R-C
Ar-Kr ion laser	Spectra-Physics	Stabilite 2018
avalanche photodiode	ALV-GmbH	ALV-High Q.E. Avalanche Photo Diode
correlator	ALV-GmbH	ALV-5000/EPP

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Hiroi, T., Shibayama, M. Measurement of Particle Size Distribution in Turbid Solutions by Dynamic Light Scattering Microscopy. J. Vis. Exp. (119), e54885, doi:10.3791/54885 (2017).

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