Мы представляем протокол для анализа коронарных сосудов в целом эмбриональных мышиных сердец до E15.5, с использованием стандартных иммунологических методов окрашивания с последующим оптическим клиренса и конфокальной микроскопии. Этот метод позволяет визуализировать кровеносные сосуды на протяжении всего сердца, без необходимости трудоемкого анализа серийных срезах.
Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard microscopy techniques, due to the scattering of imaging light by the thick heart tissue, as these vessels are localized deep within the walls of the developing heart. As optical clearing of tissues using organic solvents such as BABB (1 part benzyl alcohol to 2 parts benzyl benzoate) has been shown to greatly improve the optical penetration depth that can be achieved, we combined clearance of whole, PECAM1-immunostained hearts, with laser-scanning confocal microscopy, in order to obtain high-resolution images of vessels throughout the entire heart. BABB clearance of embryonic hearts takes place rapidly and also acts to preserve the fluorescent signal for several weeks; in addition, samples can be imaged multiple times without loss of signal. This straightforward method is also applicable to imaging other types of blood vessels in whole embryos.
Создание функционирующей коронарной сети имеет решающее значение для функции сердца и эмбрионального развития, а также анализ генетических мутантов мыши может дать ценную информацию о молекулярных сигналов, лежащих в основе этого процесса развития. Способность визуализировать эмбриональные коронарных сплетение в целом, а не представлены в серии гистологических срезов, имеет важное значение для облегчения анализа кучность сосудов в генетических мутантов, и позволяет избежать возможной потери информации, которая может возникнуть в результате механического разрезание ткани. Суда суждено сформировать артерии и капилляры локализованы глубоко внутри стенок обоих желудочков и аорты 1-3. Тем не менее, в то время как флуоресцентного мечения клеток в сочетании с лазерной сканирующей конфокальной микроскопии может обеспечить изображений с высоким разрешением Wholemount меченных поверхностных вен / лимфатическими сосудами 4,5, глубина изображения ограничена оптическим проникновением. Высокое разрешение изображения колпачкаПоэтому illaries и артерии на протяжении всей глубины сердца невозможно без какой-либо форме очистки ткани.
Плохое оптическое проникновение обусловлено высоким показателем преломления и множественной клеточной внеклеточного (например, коллагена и эластичных волокон) компонентов толстых тканей. Это рассеивает свет изображения, вызывая размытие и снижение контрастности. Клиринговые агенты, как правило, соответствуют высоким показателем преломления таких тканей, а это означает, что свет может проходить через образец беспрепятственное и проникают глубже в ткани. Перед очисткой, ткани, как правило, обезвоженной, как вода имеет относительно низкий показатель преломления. Множество новых методов клиринговых были разработаны в последнее время , тем не менее в зависимости от используемого метода, процесс удаления может занять несколько дней или недель , и может потребовать дорогостоящих реагентов 6-9. Бэбб (смесь 1: 2 бензилового спирта и бензилбензоата) является недорогим, обычно используемый осветлитель, который имеетПреимущество очистки образцов очень быстро. Бэбб на основе клиринга и обработки изображений методы были описаны ранее для неврологических образцов и различных органов 10-13. Здесь мы опишем надежный и простой метод для Бабб оформления иммуноокрашиванию образцов с последующим конфокальной микроскопии, с конкретной ссылкой на обследования кровеносных сосудов в мышиных сердцах из Е (эмбриональный день) 11,5 – 15,5. Однако, как также было продемонстрировано, методика может одинаково хорошо применяться для анализа целых эмбрионов, а также другие типы клеток, до тех пор, как высокие антитела качества к маркерам интерес доступны.
Коронарные сосуды в целом эмбрионального сердца были обследованы с помощью Wholemount иммунным окрашиванием с анти-PECAM1 антителом с последующим оптическим клиренса и конфокальной микроскопии. Простой метод, описанный здесь, для оформления эмбриональных сердца мыши с Бабб, увеличивает оптическое проникновение и обеспечивает захват изображений с высоким разрешением кровеносных сосудов, локализованных в аорте и желудочковой стенки. Глицерин на основе монтажа реагенты , такие как Vectashield (показатель преломления 1,45) также были использованы для визуализации коронарных сосудов 22 , однако, чем выше показатель преломления Бэбб (1,56) уменьшает рассеивание света еще дальше, позволяя проникновение более глубокие ткани. Тканевая оформление устраняет необходимость в более сложных, дорогостоящих форм микроскопии, таких как многофотонной и световой микроскопии листа, который может быть менее доступными для исследователей. Процесс клиринга очень быстро по сравнению с другими методами 6-9 и для малых выборок может быть чаrried с использованием небольших объемов реагентов непосредственно на микроскопии блюдо. Прочные окрашивание сосудистую требуется для того, чтобы достичь высокого качества изображения; анти-PECAM1 антитело было выбрано, как это отмечает все виды коронарного КЧС и ряда коммерческих антител были найдены, чтобы дать соответствующим образом высокие уровни окрашивания. Кроме того, флуоресцентный окрашивание по-видимому, чрезвычайно устойчивым в Бэбб; Образцы хранили при комнатной температуре в Бабб (защищенном от света месте) сохранили свой флуоресцентный сигнал в течение нескольких месяцев. Тот факт, что PECAM1 антитело эффективно маркирует коронарную эндокарда, а также сосудистую сеть от времени проблематично, особенно при съемке изображений peritruncal сплетении. Сильнее окрашивание просвет аорты по сравнению с peritruncal КЧС привело к риску чрезмерного насыщения в некоторых областях изображений, а это означает, что требуется тщательной корректировки параметров изображения. В идеале, окрашивание антитела сосудистая будет использоваться только КЭ; на практике,однако, поиск подходящих антител, которые дают необходимый уровень Wholemount окрашивания может быть затруднено. В последнее время , жирные кислоты , белок , связывающий 4 (FABP4) было показано, является маркером коронарного сосудистого КЭ 23 и , следовательно , может представлять собой альтернативу PECAM1.
Для того, чтобы сохранить 3D морфологии аорты и камер сердца образцы не были плоскими монтажа, но вместо этого были отображены в стеклянном дном посуды. Глубина образцов быть отображены не позволяют использовать высокие цели увеличения, из-за своих коротких рабочих расстояниях. Однако изображения с высоким разрешением по-прежнему достижимы с использованием объектива 10х за счет увеличения времени задержки пикселя и используя размер массива пикселей по меньшей мере 1,024 х 1,024 для захвата изображения. Этого было достаточно для анализа структуры и распределения коронарных сосудов, однако тоньше анализ клеточной структуры может потребовать плоским монтаж образцов. Вскрытие отдельных частей сердца для монтажа,например, стенок желудочков, или аорта, также могут быть необходимы. В качестве альтернативы, передискретизации изображения с последующим деконволюции может быть осуществлено с целью увеличения разрешения и чувствительности; это, однако, значительно больше требует времени сканирования и создает очень большие файлы изображений, которые требуют много вычислительной мощности для обработки.
Сердца до E15.5 были успешно визуализируют с помощью этого метода, а также можно анализировать сосудистую целых эмбрионов (по крайней мере до E11.5), используя тот же протокол. Другие типы клеток, например, клетки гладких мышц также были отображены в нашей лаборатории , используя эту технику. Для более толстых тканей, например, сердца старше E15.5, проникновение антител может быть ограничивающим фактором; больше инкубацию и / или увеличение моющего средства может потребоваться. Кроме того, при сборе большого г стопка изображений сила сигнала может быть уменьшена, поскольку лазеры проникают дальние участки ткани; однако конфÖçal параметры могут быть скорректированы, чтобы увеличить мощность лазера с увеличением расстояния г.
Этот метод облегчает конфокальной микроскопический анализ как на ранних стадиях формирования коронарных сосудов и кучность коронарных артерий на более поздних стадиях развития. Более подробная информация о распределении, разветвленности и структуры кровеносных сосудов могут быть приобретены в течение короткого времени, что делает это ценным инструментом для изучения генетических мутантов мышей с определенными дефектами ангиогенеза путей.
The authors have nothing to disclose.
Работа выполнена при финансовой поддержке British Heart Foundation'and при поддержке Национального института по исследованиям в области здравоохранения научно-исследовательского центра биомедицинской в Большом госпитале Ормонд-стрит для детей NHS Foundation Trust и Университетского колледжа Лондона.
PBS | Life Technologies | 14190-094 | |
Forceps | FST | 11251-30 | |
10cm Petri dishes | Falcon | 351029 | |
35mm Petri dishes | Sigma | P5112 | |
Stainless steel minutien pins 0.2mm diameter | FST | 26002-20 | |
Fine tip pastettes | Alpha Laboratories | LW4061 | |
1000ml pipette tips | Sorenson | 34000 | |
48-well plate | Falcon | 353078 | |
Kwik-Gard | World Precision Instrument | KWIKGARD | Silicone elastomer Sylgard184 packaged in a cartridge for mixing and dispensing |
Kwik-Gard refill | World Precision Instrument | KWIKGLUE | Refill cartridges and dispensing tips |
Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Make up in PBS and store at -20°C |
100% methanol | VWR | 20847307 | |
Tween®20 | Sigma | P1379 | |
Goat serum | Sigma | G9023 | |
Anti-PECAM1 antibody, rat anti-mouse | BD Pharmingen | 553370 | Primary antibody, dilute 1 in 50 |
Anti-CD31 polyclonal, rabbit polyclonal | Abcam | ab28364 | Primary antibody, dilute 1 in 50 |
Anti-CD31/PECAM1 clone 2H8, armenian hamster monoclonal | Thermo Fisher Scientific | MA3105 | Primary antibody, dilute 1 in 400 |
Endomucin antibody (V.7C7), rat monoclonal | Santa Cruz Biotechnology | sc-65495 | Primary antibody, dilute 1 in 50 |
Anti-SM22 alpha antibody, rabbit polyclonal | Abcam | ab14106 | Primary antibody, dilute 1 in 250 |
Goat anti-rat IgG (H+L)Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A11007 | Secondary antibody, dilute 1 in 500 |
Goat anti-rabbit IgG (H+L)Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | Secondary antibody, dilute 1 in 500 | |
Goat anti-Armenian Hamster IgG (H+L)Alexa Fluor 488 | Abcam | ab173003 | |
Goat anti-rat IgG (H+L)Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A21208 | Secondary antibody, dilute 1 in 500 |
Phenolic screw cap | Wheaton | 240408 | |
Benzyl alcohol | Sigma | 402834 | |
Benzyl benzoate | Sigma | B6630 | |
Imaris | Bitplane Imaging | image analysis software | |
Image J software | NIH | Freeware |