تحليل الأوعية التاجية في قلوب الجنينية مسح
Summary
نقدم بروتوكول لتحليل الأوعية التاجية في كامل قلوب الفئران الجنينية حتى E15.5، وذلك باستخدام أساليب تلطيخ المناعية القياسية تليها إزالة البصرية ومتحد البؤر المجهري. هذه التقنية تمكن التصور الأوعية الدموية في جميع أنحاء القلب بأكمله دون الحاجة لتحليل تستغرق وقتا طويلا من أقسام التسلسلية.
Abstract
Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard microscopy techniques, due to the scattering of imaging light by the thick heart tissue, as these vessels are localized deep within the walls of the developing heart. As optical clearing of tissues using organic solvents such as BABB (1 part benzyl alcohol to 2 parts benzyl benzoate) has been shown to greatly improve the optical penetration depth that can be achieved, we combined clearance of whole, PECAM1-immunostained hearts, with laser-scanning confocal microscopy, in order to obtain high-resolution images of vessels throughout the entire heart. BABB clearance of embryonic hearts takes place rapidly and also acts to preserve the fluorescent signal for several weeks; in addition, samples can be imaged multiple times without loss of signal. This straightforward method is also applicable to imaging other types of blood vessels in whole embryos.
Introduction
إنشاء شبكة التاجية تعمل المهم لعمل القلب والتطور الجنيني، وتحليل المسوخ الماوس الوراثية يمكن أن توفر معلومات قيمة حول الإشارات الجزيئية الكامنة وراء هذه العملية التنموية. القدرة على تصور الضفيرة التاجية الجنينية ككل، بدلا من عرضها في سلسلة من المقاطع النسيجية، أمر ضروري لتسهيل تحليل الزخرفة سفينة في المسوخ وراثية، ويتجنب الخسارة المحتملة للمعلومات التي يمكن أن تحدث نتيجة الميكانيكية تشريح الأنسجة. يتم ترجمة السفن المنكوبة لتشكيل الشرايين والشعيرات الدموية العميقة داخل أسوار كلا البطينين والشريان الأورطي 1-3. ومع ذلك، في حين وضع العلامات الفلورية الخلايا جنبا إلى جنب مع ليزر المسح المجهري متحد البؤر يمكن أن توفر صور عالية الدقة من سطحية الأوعية الوريدية / wholemount المسمى اللمفاوية 4،5، وعمق التصوير محدودة بسبب اختراق البصرية. عالية الدقة التصوير من قبعةلذا illaries والشرايين في جميع أنحاء عمق كاملة من قلب غير ممكن من دون شكل من أشكال المقاصة الأنسجة.
يحدث اختراق البصرية الفقراء تلاه مؤشر الانكسار عالية من العديد من الخلايا وخارج الخلية مكونات الأنسجة سميكة (على سبيل المثال، والكولاجين والألياف المرنة). هذا ينثر ضوء التصوير، مما تسبب في عدم وضوح وانخفاض التباين. وكلاء تطهير عادة تطابق معامل الانكسار عالية من هذه الأنسجة، وهذا يعني أن الضوء يمكن أن تنتقل من خلال عينة دون عائق وأعمق في اختراق الأنسجة. قبل المقاصة والأنسجة والمجففة عموما الماء له معامل الانكسار المنخفض نسبيا. وقد تم تطوير عدد كبير من وسائل تطهير جديدة في الآونة الأخيرة، ولكن اعتمادا على التقنية المستخدمة، فإن عملية المقاصة يمكن أن يستغرق أياما أو أسابيع وربما تتطلب الكواشف مكلفة 6-9. BABB (1: خليط 2 من الكحول البنزيل بنزوات البنزيل و) هي غير مكلفة، وتستخدم عادة كيل المقاصة، والتي لديهاالاستفادة من تطهير العينات بسرعة للغاية. وقد وصفت تقنيات المقاصة استنادا BABB والتصوير سابقا لعينات العصبية ومختلف أجهزة 10-13. نحن هنا وصف تقنية قوية ومباشرة لإزالة BABB العينات immunostained تليها المجهري متحد البؤر، مع إشارة خاصة إلى فحص الأوعية الدموية في قلوب الفئران من E (اليوم الجنينية) 11،5-15،5. لكن، وكما تمت أيضا ثبت، يمكن بالتساوي جيدا أن تطبق هذه التقنية لتحليل الأجنة كلها، فضلا عن أنواع أخرى من الخلايا، طالما هي الأجسام المضادة عالية وجودة لعلامات الفائدة المتاحة.
Protocol
Representative Results
Discussion
تم تصوير الأوعية التاجية في القلب الجنينية بأكملها المناعية wholemount مع الأجسام المضادة لمكافحة PECAM1 تليها إزالة البصرية ومتحد البؤر المجهري. طريقة واضحة وصفها هنا، لتطهير القلوب الماوس الجنينية مع BABB، ويزيد من تغلغل البصرية وتمكن من التقاط صور عالية الدقة للأوعية الدموية الموضعية في الشريان الأورطي والبطين الجدران. كما استخدمت القائم على الجلسرين الكواشف التجميع. مثل Vectashield (معامل الانكسار 1.45) لتصوير الأوعية الدموية التاجية 22 إلا أن مؤشر الانكسار أعلى من BABB (1.56) يقلل من تشتت الضوء أكثر فأكثر، مما أعمق اختراق الأنسجة. إزالة الأنسجة يغني عن الحاجة لأكثر تعقيدا، أشكال مكلفة المجهري مثل multiphoton وخفيفة المجهر ورقة والتي قد تكون أقل متناول الباحثين. عملية المقاصة سريعا للغاية بالمقارنة مع الطرق الأخرى 6-9 ولعينات صغيرة يمكن أن يكون كاليفورنياrried من استخدام كميات صغيرة من الكواشف مباشرة على طبق المجهر. مطلوب تلطيخ قوية من الأوعية الدموية من أجل تحقيق صور ذات جودة عالية؛ تم اختيار مكافحة PECAM1 الأجسام المضادة لانه يمثل جميع أنواع التاجي ECS وعدد من الأجسام المضادة التجارية وجدت لتقديم مستويات عالية بشكل مناسب من تلطيخ. وبالإضافة إلى ذلك، وتلطيخ الفلورسنت يبدو أن مستقرة للغاية في BABB. العينات المخزنة في درجة حرارة الغرفة في BABB (محمية من الضوء) احتفظت إشارة الفلورسنت لعدة أشهر. حقيقة أن PECAM1 الأجسام المضادة تسميات بكفاءة البطانة التاجية وكذلك كان الأوعية الدموية إشكالية في بعض الأحيان، خصوصا عند التقاط الصور من الضفيرة peritruncal. أدى تلطيخ أقوى من تجويف الشريان الأبهر مقارنة ECS peritruncal في خطر الإفراط في التشبع في بعض المناطق من الصور، وهذا يعني أن تعديل دقيق للمعلمات التصوير كان مطلوبا. من الناحية المثالية، وتلوين الأجسام المضادة فقط الأوعية الدموية ECS ستستخدم. في التمرين،ومع ذلك، وإيجاد الأجسام المضادة المناسبة التي تحقق المستوى المطلوب من تلطيخ wholemount يمكن أن يكون صعبا. في الآونة الأخيرة، وقد تبين الأحماض الدهنية بروتين ملزمة 4 (FABP4) ليكون علامة من التاجي الأوعية الدموية ECS 23، وبالتالي يمكن أن تمثل بديلا للPECAM1.
من أجل الحفاظ على التشكل 3D من الشريان الأورطي والقلب غرف كانت العينات يست مسطحة مثبتة، ولكن بدلا من ذلك تم تصويرها في أطباق ذات قاع زجاجي. عمق العينات المراد تصويرها يمنع استخدام الأهداف التكبير عالية، نظرا لمسافات عمل قصيرة بهم. لا تزال مع ذلك صور عالية الدقة للتحقيق باستخدام الهدف 10X عن طريق زيادة الوقت بكسل يسكن واستخدام حجم البكسل مجموعة من 1024 س 1024 على الأقل لالتقاط الصور. وكان هذا كافيا لتحليل هيكل وتوزيع الأوعية التاجية، ولكن تحليل أكثر دقة للهيكل الخلوي قد تتطلب تصاعد-شقة من العينات. تشريح الأجزاء الفردية من القلب للتركيب،على سبيل المثال، جدران البطين، أو الشريان الأورطي، قد يكون من الضروري أيضا. بدلا من ذلك، والإفراط في أخذ العينات من صورة تليها deconvolution يمكن القيام بها من أجل زيادة دقة وحساسية. ولكن هذا يتطلب وقتا أطول الأوقات المسح، ويخلق صورة صورة كبيرة للغاية التي تتطلب الكثير من القدرة الحاسوبية لمعالجة.
قلوب تصل إلى E15.5 تم تصوير بنجاح باستخدام هذه الطريقة، وأنه من الممكن أيضا لتحليل الأوعية الدموية للأجنة كاملة (إلى E11.5 على الأقل) باستخدام نفس البروتوكول. كما تم تصوير أنواع الخلايا الأخرى، على سبيل المثال، خلايا العضلات الملساء في مختبرنا باستخدام هذه التقنية. لأنسجة سمكا، على سبيل المثال، قلوب كبار السن من E15.5، يمكن اختراق الأجسام المضادة يكون عاملا مقيدا. قد تكون هناك حاجة حضانات أطول و / أو زيادة المنظفات. وبالإضافة إلى ذلك، عندما جمع ض كومة كبيرة من الصور قوة الإشارة يمكن أن تخفض مثل الليزر تخترق أبعد أجزاء من الأنسجة. ولكن أسيوطيمكن تعديل إعدادات OCAL لزيادة قوة الليزر مع زيادة المسافة ض.
يسهل هذا أسلوب التحليل المجهري متحد البؤر كل المراحل الأولى من تكوين الأوعية التاجية والزخرفة من الشرايين التاجية في مراحل النمو اللاحقة. يمكن الحصول على معلومات مفصلة حول توزيع، المتفرعة وهيكل الأوعية الدموية في وقت قصير، مما يجعل هذه أداة قيمة لدراسة المسوخ الماوس الوراثية مع عيوب معينة في مسارات الأوعية الدموية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل القلب Foundation'and البريطاني بدعم من المعهد الوطني للمركز البحوث الطبية الحيوية بحوث الصحية في مستشفى جريت أورموند ستريت للأطفال مؤسسة سالفورد وجامعة كوليدج في لندن.
Materials
| PBS | Life Technologies | 14190-094 | |
| Forceps | FST | 11251-30 | |
| 10cm Petri dishes | Falcon | 351029 | |
| 35mm Petri dishes | Sigma | P5112 | |
| Stainless steel minutien pins 0.2mm diameter | FST | 26002-20 | |
| Fine tip pastettes | Alpha Laboratories | LW4061 | |
| 1000ml pipette tips | Sorenson | 34000 | |
| 48-well plate | Falcon | 353078 | |
| Kwik-Gard | World Precision Instrument | KWIKGARD | Silicone elastomer Sylgard184 packaged in a cartridge for mixing and dispensing |
| Kwik-Gard refill | World Precision Instrument | KWIKGLUE | Refill cartridges and dispensing tips |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Make up in PBS and store at -20°C |
| 100% methanol | VWR | 20847307 | |
| Tween®20 | Sigma | P1379 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| Anti-PECAM1 antibody, rat anti-mouse | BD Pharmingen | 553370 | Primary antibody, dilute 1 in 50 |
| Anti-CD31 polyclonal, rabbit polyclonal | Abcam | ab28364 | Primary antibody, dilute 1 in 50 |
| Anti-CD31/PECAM1 clone 2H8, armenian hamster monoclonal | Thermo Fisher Scientific | MA3105 | Primary antibody, dilute 1 in 400 |
| Endomucin antibody (V.7C7), rat monoclonal | Santa Cruz Biotechnology | sc-65495 | Primary antibody, dilute 1 in 50 |
| Anti-SM22 alpha antibody, rabbit polyclonal | Abcam | ab14106 | Primary antibody, dilute 1 in 250 |
| Goat anti-rat IgG (H+L)Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A11007 | Secondary antibody, dilute 1 in 500 |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L)Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | Secondary antibody, dilute 1 in 500 | |
| Goat anti-Armenian Hamster IgG (H+L)Alexa Fluor 488 | Abcam | ab173003 | |
| Goat anti-rat IgG (H+L)Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A21208 | Secondary antibody, dilute 1 in 500 |
| Phenolic screw cap | Wheaton | 240408 | |
| Benzyl alcohol | Sigma | 402834 | |
| Benzyl benzoate | Sigma | B6630 | |
| Imaris | Bitplane Imaging | image analysis software | |
| Image J software | NIH | Freeware |
References
- Red-Horse, K., Ueno, H., Weissman, I. L., Krasnow, M. A. Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells. Nature. 464 (7288), 549-553 (2010).
- Tian, X., et al. Subepicardial endothelial cells invade the embryonic ventricle wall to form coronary arteries. Cell Res. 23 (9), 1075-1090 (2013).
- Wu, B., et al. Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling. Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).
- Klotz, L., et al. Cardiac lymphatics are heterogeneous in origin and respond to injury. Nature. 522 (7554), 62-67 (2015).
- Nam, J., et al. Coronary veins determine the pattern of sympathetic innervation in the developing heart. Development. 140 (7), 1475-1485 (2013).
- Zhu, D., Larin, K. V., Luo, Q., Tuchin, V. V. Recent progress in tissue optical clearing. Laser Photon. Rev. 7 (5), 732-757 (2013).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nat. Methods. 10 (6), 508-513 (2013).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat. Neurosci. 14 (11), 1481-1488 (2011).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat. Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat. Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
- Zucker, R. M., Hunter, E. S., Rogers, J. M. Confocal laser scanning microscopy of morphology and apoptosis in organogenesis-stage mouse embryos. Methods Mol. Biol. 135, 191-202 (2000).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat. Protoc. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Erturk, A., Lafkas, D., Chalouni, C. Imaging cleared intact biological systems at a cellular level by 3DISCO. J. Vis.Exp : JoVE. (89), (2014).
- Dyer, L. A., Wu, Y., Patterson, C. Protein isolation from the developing embryonic mouse heart valve region. J. Vis.Exp s : JoVE. (91), e51911 (2014).
- Wilsbacher, L. D., Coughlin, S. R. Analysis of cardiomyocyte development using immunofluorescence in embryonic mouse heart. J. Vis.Exp : JoVE. (97), (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Tian, X., Pu, W. T., Zhou, B. Cellular origin and developmental program of coronary angiogenesis. Circ. Res. 116 (3), 515-530 (2015).
- Ivins, S., et al. The CXCL12/CXCR4 Axis Plays a Critical Role in Coronary Artery Development. Dev. Cell. 33 (4), 455-468 (2015).
- Theveniau-Ruissy, M., et al. Coronary stem development in wild-type and Tbx1 null mouse hearts. Dev. Dyn : an official publication of the American Association of Anatomists. 245 (4), 445-459 (2016).
- Tomanek, R. J. Formation of the coronary vasculature during development. Angiogenesis. 8 (3), 273-284 (2005).
- Chen, H. I., et al. VEGF-C and aortic cardiomyocytes guide coronary artery stem development. J. Clin.Iinvest. 124 (11), 4899-4914 (2014).
- Tian, X., et al. Vessel formation. De novo formation of a distinct coronary vascular population in neonatal heart. Science. 345 (6192), 90-94 (2014).
