We presenteren een protocol voor de analyse van coronairvaten geheel muriene embryonale hart tot E15.5, met behulp van standaard immunologische werkwijzen kleuring gevolgd door optische klaring en confocale microscopie. Deze techniek maakt visualisatie van bloedvaten door het gehele hart zonder dat tijdrovende analyse van seriële secties.
Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard microscopy techniques, due to the scattering of imaging light by the thick heart tissue, as these vessels are localized deep within the walls of the developing heart. As optical clearing of tissues using organic solvents such as BABB (1 part benzyl alcohol to 2 parts benzyl benzoate) has been shown to greatly improve the optical penetration depth that can be achieved, we combined clearance of whole, PECAM1-immunostained hearts, with laser-scanning confocal microscopy, in order to obtain high-resolution images of vessels throughout the entire heart. BABB clearance of embryonic hearts takes place rapidly and also acts to preserve the fluorescent signal for several weeks; in addition, samples can be imaged multiple times without loss of signal. This straightforward method is also applicable to imaging other types of blood vessels in whole embryos.
De oprichting van een functionerend coronaire netwerk is cruciaal voor de werking van het hart en de embryonale ontwikkeling, en de analyse van genetische muismutanten kan waardevol inzicht verschaffen in de moleculaire signalen die ten grondslag liggen aan dit ontwikkelingsproces. De mogelijkheid om de embryonale coronaire plexus visualiseren als een geheel en niet bestaat uit een serie van histologische coupes, is essentieel voor de analyse van het vaartuig patronen in genetische mutanten vergemakkelijken, en vermijdt de potentiële verlies van informatie die kan optreden als gevolg van mechanische snijden van het weefsel. Schepen gedoemd om bloedvaten te vormen en haarvaten zijn gelokaliseerd diep binnen de muren van zowel de ventrikels en de aorta 1-3. Ofschoon fluorescente labeling van cellen in combinatie met laser scanning confocale microscopie kan een hoge resolutie beelden van wholemount gelabelde oppervlakkige veneuze / lymfevaten 4,5, de diepte van beeldvorming wordt beperkt door optische penetratie. Hoge-resolutie beeldvorming van capillaries en slagaders gedurende de gehele diepte van het hart is daarom niet mogelijk zonder enige vorm van weefsel clearing.
Slechte optische penetratie wordt veroorzaakt door de hoge brekingsindex van de meervoudige cellulaire en extracellulaire (bijvoorbeeld collageen en elastische vezels) componenten dikke weefsels. Dit verstrooit de beeldvormende licht, waardoor vervaging en verminderde contrast. Clearing agenten overeenkomen meestal de hoge brekingsindex van dergelijke weefsels, wat betekent dat het licht kan reizen door het monster vrij en dieper doordringen in het weefsel. Voordat clearing, weefsels zijn over het algemeen uitgedroogd als water heeft een relatief lage brekingsindex. Een overvloed aan nieuwe clearing werkwijzen zijn recent ontwikkeld, maar afhankelijk van de gebruikte, het zuiveringsproces kan dagen of weken duren en kostbare reagentia nodig 6-9 techniek. BABB (een 1: 2 mengsel van benzylalcohol en benzylbenzoaat) is een goedkope, gebruikelijke klaringsmiddel, die isvoordeel van clearing monsters zeer snel. BABB-clearing en beeldvorming zijn eerder beschreven voor neurologische monsters en verschillende organen 10-13. Hier beschrijven we een robuuste en eenvoudige techniek voor de BABB klaring van immunostained monsters, gevolgd door confocale microscopie, met een specifieke verwijzing naar het onderzoek van de bloedvaten in muizen harten van E (embryonale dag) 11,5-15,5. Zoals echter ook aangetoond, de techniek kan evengoed worden toegepast op de analyse van hele embryo, evenals andere celtypen, zolang kwaliteit antilichamen tegen de markers van belang zijn.
Coronaire vaten geheel embryonale harten werden afgebeeld door wholemount immunokleuring met anti-PECAM1 antilichaam gevolgd door optische klaring en confocale microscopie. De eenvoudige methode die hier beschreven, voor de goedkeuring van de embryonale muis harten met BABB, verhoogt de optische penetratie en maakt het vastleggen van beelden met hoge resolutie van de bloedvaten gelokaliseerd in de aorta en ventriculaire muren. Glycerol gebaseerde montage reagentia zoals Vectashield (brekingsindex 1,45) zijn ook gebruikt voor beeldvorming van de coronaire vasculatuur 22 maar de hogere brekingsindex van BABB (1,56) vermindert lichtverstrooiing nog verder, waardoor diepere penetratie. Weefsel speling ondervangt de behoefte aan complexe, dure vormen van microscopie zoals multifoton microscopie en lichte plaat die minder toegankelijk voor onderzoekers mogelijk. Het zuiveringsproces is zeer snel in vergelijking met andere werkwijzen 6-9 en kleine monsters kan carried met behulp van kleine hoeveelheden van de reagentia direct aan de microscopie schotel. Robuuste kleuring van het vaatstelsel vereist om beelden van hoge kwaliteit te bereiken; anti-PECAM1 antilichaam werd geselecteerd als het markeert alle soorten coronaire EC en een aantal commerciële antilichamen bleken voldoende hoge niveaus van kleuring geven. Bovendien lijkt de fluorescente kleuring zeer stabiel in BABB; monsters bewaard bij kamertemperatuur in BABB (beschermd tegen licht) behielden hun fluorescentiesignaal enkele maanden. Dat PECAM1 antilichaam efficiënt labelt de coronaire endocardium en de vasculatuur was soms problematisch, vooral bij opname van de peritruncal plexus. Sterkere kleuring van de aorta lumen tegenover het peritruncal EC tot een risico van oververzadiging in sommige gebieden van de beelden, wat betekent dat een zorgvuldige aanpassing van de beeldvormende parameters nodig was. Idealiter een antilichaam kleuring alleen vasculaire EC's worden gebruikt; in praktijk,Het vinden van geschikte antilichamen die het vereiste wholemount kleuring verkregen kan moeilijk zijn. Onlangs heeft vetzuurbindend eiwit 4 (FABP4) blijkt een marker van hart- EC 23 en derhalve kan een alternatief PECAM1 vertegenwoordigen.
Om de 3D morfologie van de aorta en hartkamers werden de monsters niet vlak gemonteerde behouden, maar werden in plaats daarvan afgebeeld in glazen bodem gerechten. De diepte van de monsters af te beelden uitgesloten het gebruik van hoge doelstellingen vergroting vanwege hun korte werkafstand. Maar een hoge resolutie beelden waren nog steeds haalbaar is met behulp van een 10x doelstelling door het verhogen van pixel verblijftijd en het gebruik van een pixel array size van ten minste 1024 x 1024 voor het vastleggen van beelden. Dit was voldoende voor de analyse van de structuur en de verdeling van de kransslagaders, maar fijnere analyse van de cellulaire structuur vereisen vlakke montage van monsters. Dissectie van afzonderlijke delen van het hart voor de montage,bijvoorbeeld ventrikel wanden en aorta, kan ook nodig zijn. Als alternatief, over-bemonstering van het beeld, gevolgd door deconvolutie kan worden uitgevoerd om de resolutie en gevoeligheid te verhogen uitgevoerd; Dit vereist echter aanzienlijk langere scantijden en zorgt voor extreem grote beeldbestanden die veel rekenkracht te verwerken vereisen.
Harten tot E15.5 succesvol afgebeeld met behulp van deze methode, en het is ook mogelijk om de vasculatuur van gehele embryo's (tot ten minste E11.5) analyseren met hetzelfde protocol. Andere celtypen, zoals gladde spiercellen zijn eveneens afgebeeld in ons laboratorium met deze techniek. Voor dikkere weefsels, bijvoorbeeld harten ouder dan E15.5, kan antilichaam penetratie beperkende factor; langere incubaties en / of verhoogde schoonmaakmiddel vereist. Bovendien, bij het verzamelen van een groot z stapel afbeeldingen signaalsterkte kan worden gereduceerd omdat de lasers doordringen in de verste delen van het weefsel; maar de confokale kunnen worden aangepast aan laservermogen toenemen met toenemende afstand z.
Deze methode maakt confocale microscopische analyse van zowel de vroegste stadia van de vorming kransslagader en patroonvorming van de kransslagaders in latere ontwikkelingsstadia. Gedetailleerde informatie over de verdeling, vertakking en structuur van bloedvaten kan in korte tijd worden verkregen, waardoor dit een waardevol hulpmiddel voor de studie van genetische muizenmutanten specifieke defecten in angiogenese trajecten.
The authors have nothing to disclose.
Het werk werd gefinancierd door de British Heart Foundation'and ondersteund door het National Institute for Health Research Biomedical Research Centre in Great Ormond Street Hospital for Children NHS Foundation Trust en University College London.
PBS | Life Technologies | 14190-094 | |
Forceps | FST | 11251-30 | |
10cm Petri dishes | Falcon | 351029 | |
35mm Petri dishes | Sigma | P5112 | |
Stainless steel minutien pins 0.2mm diameter | FST | 26002-20 | |
Fine tip pastettes | Alpha Laboratories | LW4061 | |
1000ml pipette tips | Sorenson | 34000 | |
48-well plate | Falcon | 353078 | |
Kwik-Gard | World Precision Instrument | KWIKGARD | Silicone elastomer Sylgard184 packaged in a cartridge for mixing and dispensing |
Kwik-Gard refill | World Precision Instrument | KWIKGLUE | Refill cartridges and dispensing tips |
Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Make up in PBS and store at -20°C |
100% methanol | VWR | 20847307 | |
Tween®20 | Sigma | P1379 | |
Goat serum | Sigma | G9023 | |
Anti-PECAM1 antibody, rat anti-mouse | BD Pharmingen | 553370 | Primary antibody, dilute 1 in 50 |
Anti-CD31 polyclonal, rabbit polyclonal | Abcam | ab28364 | Primary antibody, dilute 1 in 50 |
Anti-CD31/PECAM1 clone 2H8, armenian hamster monoclonal | Thermo Fisher Scientific | MA3105 | Primary antibody, dilute 1 in 400 |
Endomucin antibody (V.7C7), rat monoclonal | Santa Cruz Biotechnology | sc-65495 | Primary antibody, dilute 1 in 50 |
Anti-SM22 alpha antibody, rabbit polyclonal | Abcam | ab14106 | Primary antibody, dilute 1 in 250 |
Goat anti-rat IgG (H+L)Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A11007 | Secondary antibody, dilute 1 in 500 |
Goat anti-rabbit IgG (H+L)Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | Secondary antibody, dilute 1 in 500 | |
Goat anti-Armenian Hamster IgG (H+L)Alexa Fluor 488 | Abcam | ab173003 | |
Goat anti-rat IgG (H+L)Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A21208 | Secondary antibody, dilute 1 in 500 |
Phenolic screw cap | Wheaton | 240408 | |
Benzyl alcohol | Sigma | 402834 | |
Benzyl benzoate | Sigma | B6630 | |
Imaris | Bitplane Imaging | image analysis software | |
Image J software | NIH | Freeware |