Die Analyse der Herzkranzgefäße in Gelöscht Embryonale Herz

Alle Tierforschung wurde gemäß den Richtlinien des Instituts unter der Lizenz von der britischen Home Office durchgeführt. 1. Dissection und Fixierung von Embryonic Herzen Euthanize eine zeitlich schwangeren Maus auf den gewünschten Tag eine ethisch genehmigt Culling – Technik, zum Beispiel CO 2 narcosis gefolgt von Zervikaldislokation verwenden, und entfernen Sie die embryonale Säcke 14, so dass sie in einer 10 cm Petrischale mit phosphatgepufferter Salzlösung gefüllt platzieren (PBS) . Mit einem Binokular und einer Pinzette vorsichtig die Gebärmutter-Säckchen öffnen und jeden Embryo zu entfernen, die Nabelschnur Abtrennen und den Dottersack zu entfernen. Für die Genotypisierung Zwecke, entfernen Sie die embryonale Schwanz und in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen für die Lyse / DNA-Extraktion später. Um das Herz, pin jeder Embryo aus auf dem Rücken in einem PBS-gefüllten Silikonelastomer beschichtete 35 mm Petrischale mit Edelstahl minutien Stifte zu entfernen. Mit einer feinen Pinzette, carefully die Truhe öffnen und trennen die großen Gefäße, anterioren zum Herzen. Dann erreichte mit der Zange hinter dem Herzen, fassen die Schiffe hinter dem Herzen und ziehen Sie das Herz zu entfernen; die Lungen weg kommen können auch gleichzeitig an. Übertragen Sie das Herz in ein frisches 35 mm Petrischale mit PBS und verwenden feinen Pinzette das Lungengewebe zu wegschneiden, falls erforderlich. Dann übertragen, das Herz zu einer Vertiefung einer 48-Well-Platte mit kaltem PBS gefüllt. Sie alle Herzen in der 48-Well-Platte absaugen PBS mit einem spitzen Plastik Pasteur-Pipette und ersetzen mit 0,5 ml 4% Paraformaldehyd (PFA) Nach dem Sammeln. ACHTUNG: PFA ist ein bekanntes allergen, krebserregend zu sein, und giftig. Fix E11,5 – 12,5 Herzen für 15 min, E13.5 Herzen für 20 min und E14,5 – 15,5 Herzen für 30 min in 4% PFA bei Raumtemperatur. Saugen Sie das PFA mit einem spitzen Kunststoff Pasteurpipette und spülen Sie die Herzen 2x in kaltem PBS. CAUTION: PFA ist gefährlich und müssen in Einklang mit den institutionellen Vorschriften entsorgt werden. Wenn sie nicht sofort für ganze Berg Immunfärbung mit (siehe Abschnitt 2), dehydrieren die Herzen durch aufeinanderfolgende 5 min Waschen in den folgenden Lösungen Durchführung: 25% Methanol / 75% PBS, 50% Methanol / 50% PBS, 75% Methanol / 25 % PBS. VORSICHT: Methanol ist giftig, Handschuhe zu tragen. Lagern Sie die Herzen bei -20 ° C in 100% Methanol. 2. Ganze Berge Immunostaining embryonaler Herzen mit Anti-PECAM1 Antikörper HINWEIS: Anti-PECAM1 Antikörper eignen sich gut für die Herzkranzgefäße Färbung (siehe Schritt 2.4), aber jede pan-endothelialen Marker, der ein robustes Signal gibt wäre geeignet. Bei der Verwendung von Herzen, die in 100% Methanol gespeichert wurden, übertragen auf 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und rehydratisieren durch aufeinanderfolgende 5 min Waschen in den folgenden Lösungen Durchführung: 75% Methanol / 25% PBS, 50% Methanol / 50% PBS und 25% Methanol / 75% PBS. </li> Permeabilisierung die Herzen, indem man 3 x 10 min Waschen in 0,5 bis 1,0 ml PBST (PBS / 0,1% Tween-20), Drehen bei Raumtemperatur. Blockieren Sie die Herzen durch Drehen für 1 Stunde bei Raumtemperatur in 1,0 ml 10% Ziegenserum in PBST. Entfernen Blockierungspuffer mit einem spitzen Kunststoff Pasteur-Pipette oder 1000 ul Pipettenspitze und ersetzen mit 400 bis 500 & mgr; l frisch Block der Anti-PECAM1 primären Antikörper enthält 01.50 verdünnt. Drehen Sie die Rohre über Nacht bei 4 ° C. Am nächsten Tag absaugen Block / primären Antikörper mit einem feinen Spitze Pipette Plastik Pasteur oder 1000 ul Pipettenspitze und führen mindestens 6x 1 Stunde Waschungen in 1,0 ml PBST, die Röhrchen bei Raumtemperatur rotiert. Ersetzen Sie die letzte Wäsche mit frischem Blockierungspuffer das Fluorophor-konjugierten sekundären Antikörper verdünnt 1, enthaltend: 500, und Inkubation über Nacht bei 4 ° C, mit einer Drehung. Vor Licht durch die Rohre in Folie wickeln. Am folgenden Tag absaugen Block / skundären Antikörper mit einem spitzen Kunststoff Pasteurpipette und tragen mindestens 6x 1 Stunde Waschungen in 1,0 ml PBST aus, die Röhrchen bei Raumtemperatur rotiert. Lagern Sie die Herzen bei 4 ° C (lichtgeschützt) bis benötigt. 3. Herstellung von Clearing-Lösungen und Mikroskopie Geschirr HINWEIS: Bei der Abbildung Herzen in BABB ist es wichtig, dass keine der BABB Lösung in Kontakt mit den Komponenten des Mikroskops kommt. Dazu wird das folgende Protokoll enthält Anweisungen zur Herstellung von Siliconelastomer versiegelten Geschirr geeignet für die Fluoreszenzmikroskopie, die gut vorbereitet werden kann. Das Silikon-Elastomer stellt eine Barriere die BABB enthalten und verhindern, dass es möglicherweise zwischen dem Glasboden sickert und die Polycarbonat-Seiten der Schale. Zur Herstellung der Silikonelastomer-beschichteten Schalen, nehmen optische Glasboden Kulturschalen und legen Sie eine Kappe aus einem 4 ml mit Schraubverschluss Fläschchen (ca. 1,5 cm im Durchmesser) In der Mitte jedes Gericht. Hinweis: Dadurch wird eine gut für die Probe bilden, wenn das Elastomer in die Schale aufgebracht wird. Füllen des Geschirrs mit Silikonelastomer bis zu einer Tiefe von etwa 0,5 cm, einen Applikator Patrone unter Verwendung der beiden Komponenten zu mischen, wie sie angewendet werden, entsprechend den Anweisungen des Herstellers. Lassen Sie für mindestens 24 Stunden aushärten, um sicherzustellen, dass die Verschlusskappe in der Mitte jeder Schale bleibt. HINWEIS: Eine Schutzbrille verwenden zufällige Berührung des Silikon-Elastomer mit den Augen zu vermeiden. Nachdem das Elastomer Aushärten das Fläschchen Kappe aus jeder Schale zu entfernen, wird dies eine zentrale gut verlassen, wo die Probe in direktem Kontakt gebracht werden mit dem Glasboden der Schale abgebildet werden können. HINWEIS: wenn sie gehärtet ist das Elastomer sollte zur Note fest und trocken sein. Bereiten Sie die BABB Lösung (1 Teil Benzylalkohol zu 2 Teilen Benzylbenzoat). Dies sollte von Licht in einer Glasflasche und geschützt aufbewahrt werden. ACHTUNG: BABB ist eine giftige, ätzende Lösung. Griff in einem Abzug, während geeignete Schutzkleidung tragen. (- 5 ml 1) in einem Glasfläschchen Mix BABB und Methanol 50:50 Lösung herzustellen. Vor Licht schützen, zum Beispiel durch das Fläschchen in Folie gewickelt wird . 4. Dehydration, Clearing und Montage von Herzen für konfokale Mikroskopie HINWEIS: Größere Proben können in 4 ml Glasfläschchen, jedoch für kleine Proben (zB Herz bis E13.5) gelöscht werden , ist es besser, den Clearing – Prozess durchführen direkt in der Mikroskopie Gericht. Dies hilft zu verhindern, 'verlieren', um die Proben als die Herzen sehr transparent geworden einmal gelöscht. Für diese kleinen Proben ist Clearing sehr schnell, innerhalb weniger Minuten auftreten. Hinweis: Schützen Sie die Proben vor Licht während alle folgenden Schritte durch Umwickeln / Abdeckung Rohre und Gerichte mit Folie. Vor dem Löschen entwässern die immunhistochemisch-Herzen durch eine Methanol-Serie durch die Herzen bei Raum tempe rotierendenratur in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen in aufeinanderfolgenden Änderungen der folgenden Lösungen: 25% Methanol / 75% PBS, 50% Methanol / 50% PBS und 75% Methanol / 25% PBS (5 min in jedem). Schließlich drehen für 3 x 5 min in 100% Methanol. Für bis zu Herzen E13.5, Platz in der Mitte der Mikroskopie Schale; unter dem Mikroskop sicherzustellen, wird das Herz mit seiner Rückenseite nach oben orientiert. Entfernen Sie das Methanol aus um das Herz mit einem feinen Spitze Kunststoff Pasteurpipette. Mit einem sauberen fein kippte Kunststoff Pasteurpipette hinzufügen BABB: Methanol 50:50 Lösung in einem ausreichenden Volumen, das Herz zu tauchen (etwa 300 bis 400 & mgr; l). Da die Herzen manchmal in der Lösung umdrehen kann, prüfen Sie erneut die Orientierung, während die Herzen immer noch undurchsichtig sind. Lassen Sie in der Lösung für 5 min. Entfernen Sie die 50:50 Lösung auf eine Glasabfallflasche in der Abzugshaube und ersetzen mit BABB, wieder mit einem spitzen Kunststoff Pasteurpipette. HINWEIS: Ein großes Volumen ist nicht erforderlich; hinzufügen ausriziente so dass das Herz sitzt in einem Tropfen der Lösung. Das Herz sollte innerhalb von 5 min zu löschen. Für größere Herzen, deaktivieren Sie die Proben in Glasfläschchen. HINWEIS: Ein E15.5 Herz innerhalb von 30 min-1 Stunde löschen soll, kann aber über Nacht bei Bedarf überlassen werden. Nachdem die Probe klar ist, um die Lösung zu entfernen und mit einem minimalen Volumen BABB ersetzen. Optional umfassen die Probe mit einem Deckglas, um es an Ort und Stelle zu halten, was jedoch nicht unbedingt erforderlich ist. Verwenden Sie das Herz für die Bildgebung. 5. Imaging Gelöscht Herzen durch konfokale Mikroskopie HINWEIS: Die Bilder wurden auf einem invertierten konfokalen Mikroskop 10X oder 20X Trockenobjektive mit erfasst. Obwohl es möglich ist, die Gerichte auf einer aufrechten konfokalen zu verwenden, muss besonders vorsichtig Kontakt des Objektivs mit der BABB Lösung zu vermeiden. Sammeln Sie ein z-Scan des Herzens 15. Je nach Größe des Herzens, kann eine Kachel – Scan das ganze Herz 16 bis Bild erforderlich. <br/> ACHTUNG: BABB ist eine ätzende Lösung, saubere Handschuhe tragen und sicherstellen , dass die Außenseite der Mikroskopie Schale frei von BABB ist. Behandeln Sie die Schale vorsichtig und halten Sie den Deckel auf die Schüssel das Risiko einer versehentlichen Verschütten auf das Mikroskop zu minimieren. Wenn es das Ziel Arbeitsabstand ermöglicht, verwenden Sie eine höhere Vergrößerung höher auflösende Bilder von Regionen von Interesse zu erreichen. 6. Datenanalyse mit Fidschi Software Öffnen Sie die z Stapel von Bildern in Fidschi 17. Um az Projektion des gesamten Stapels oder einen Teil davon zu machen, klicken Sie auf das Bild und wählen Sie Stapel, gefolgt von Z-Projekt. Geben Sie die Start- und Stopp – Slice – Nummern, und wählen Sie die Art der z – Projektion, zB mittlere Intensität, max Intensität. So markieren Sie einzelne Schiffe innerhalb eines Stapels von Bildscheiben für den Blow-Werkzeug (aus dem Plug-Ins-Menü wählen Sie Segmentation und dann Schlag / Lasso-Werkzeug) und klicken Sie auf die Bereiche des Bildes werden in ea gefülltch in Scheiben schneiden. Verwenden Sie den Fill-Befehl (klicken Sie auf Bearbeiten, und wählen Sie dann Fill) die ausgewählten Bereiche mit der Vordergrundfarbe zu füllen (klicken Sie auf Bearbeiten, und wählen Sie Optionen, gefolgt von Farben und Vordergrund). Z-Projekt nach wie vor das Bild stapeln. 7. 3D-Oberflächen Volume Rendering von Koronararterien generiert Imaris Verwendung Klicken Sie auf das Symbol Ansicht Surpass am oberen Rand des Bildschirms und ziehen Sie die Bilddatei in das Datenfenster. Klicken Sie auf das 3D-Ansicht-Symbol am oberen Rand des Bildschirms. Wählen Sie das Oberflächen-Symbol (blaues Symbol) und klicken Sie dann auf die Registerkarte Erstellen. Klicken Sie auf "Weiter automatische Erstellung, manuell bearbeiten" Dialogfeld und klicken Sie auf das Draw-Symbol (dünne Bleistiftsymbol). Wählen Sie die Kontur Tab und dann auf die Registerkarte Modus. Im Modus, klicken Sie auf den Zauberstab oder isoline Symbole. Wählen Sie den Zeiger-Modus in der Pointer-Auswahl auf der rechten Seite des Bildschirms, indem Sie neben "Select", und klicken Sie dann auf die "Draw9; Box (in der linken unteren Ecke des Bildschirms). Verwenden Sie die Isolinie oder Zauberstab-Werkzeug die Konturen der Arterien in den aufeinanderfolgenden Scheiben zu wählen. Navigieren Sie von Schicht zu Schicht der Scheibe Position Schieberegler. Wenn alle Konturen ausgewählt haben, klicken Sie auf das Oberflächenfeld erstellen. Die umgebende Volumen kann unsichtbar gemacht werden, oder mehr oder weniger undurchsichtig unter Verwendung der Blend-Modus wiedergegeben; Klicken Sie auf Volume um es zu markieren und dann auf die Registerkarte Einstellungen wählen, die Registerkarte Modus gefolgt. Wählen Sie Blend und den Schieberegler verwenden, um die Opazität ändern. Zum Aufzeichnen von Bildern mit der Snapshot-Funktion.