SILAC Based proteômica Caracterização de exossomas de HIV-1 células infectadas
Summary
Aqui, nós descrevemos um método proteómica quantitativa utilizando a técnica de marcação por isótopos estáveis aminoácidos em cultura de células (SILAC) para analisar os efeitos da infecção por HIV-1 em proteomas exosomal hospedeiro. Este protocolo pode ser facilmente adaptado a diferentes células sob condições de stress ou infecções.
Abstract
Proteomics is the large-scale analysis of proteins. Proteomic techniques, such as liquid chromatography tandem mass spectroscopy (LC-MS/MS), can characterize thousands of proteins at a time. These powerful techniques allow us to have a systemic understanding of cellular changes, especially when cells are subjected to various stimuli, such as infections, stresses, and specific test conditions. Even with recent developments, analyzing the exosomal proteome is time-consuming and often involves complex methodologies. In addition, the resultant large dataset often needs robust and streamlined analysis in order for researchers to perform further downstream studies. Here, we describe a SILAC-based protocol for characterizing the exosomal proteome when cells are infected with HIV-1. The method is based on simple isotope labeling, isolation of exosomes from differentially labeled cells, and mass spectrometry analysis. This is followed by detailed data mining and bioinformatics analysis of the proteomic hits. The resultant datasets and candidates are easy to understand and often offer a wealth of information that is useful for downstream analysis. This protocol is applicable to other subcellular compartments and a wide range of test conditions.
Introduction
Muitas doenças humanas, incluindo infecções virais, estão muitas vezes associados com os processos celulares distintos que ocorrem e em torno das células afectadas. Proteínas, muitas vezes agindo como os efetores celulares finais, mediar estes processos. Análise das proteínas muitas vezes pode fornecer informações valiosas quanto ao ambiente local das células afetadas e ajudar-nos a compreender o mecanismo subjacente da patogênese da doença. Entre as várias técnicas de análise de proteínas, proteômica detém particularmente grande promessa. Como uma ferramenta poderosa, em larga escala, proteómica pode fornecer uma compreensão sistémica de processos celulares, particularmente na área da função e da interacção de proteínas. A análise de proteínas específicas é simplificada através do desenvolvimento de técnicas de marcação, que permitem que os investigadores para monitorar a expressão de componentes celulares, particularmente proteínas, no local da investigação. Embora muitas análises proteomic foram realizados em celularescala proteoma, caracterizações proteômicas em compartimentos subcelulares provaram ser particularmente informativa 1. Isto é exemplificado bem nos estudos de infecção por HIV-1.
Exossomos, 30-100 vesículas de membrana nm secretadas por uma ampla gama de tipos de células 2, 3, são componentes essenciais da comunicação intercelular e de transporte molecular. Eles foram previamente descoberto para desempenhar papéis importantes no processo de VIH-1 de brotamento 4, 5. Ao combinar a análise proteômica com dissecção funcional, descobrimos que exossomos libertados de HIV-1 células infectadas são compostos de uma única e quantitativamente diferentes assinatura proteína e porto moléculas regulatórias que afetam propriedades celulares em células receptoras, incluindo apoptose e proliferação celular 6 vizinho. Os métodos são descritos neste protocolo,nomeadamente SILAC (rotulagem isótopo estável por aminoácidos de cultura de células) 7 com base caracterização proteomic de exossomas a partir do HIV-1 de células infectadas. Abordagens semelhantes podem ser aplicados para entender melhor outros compartimentos subcelulares durante patogênese ajustando o esforço experimental para o compartimento ou fracção de interesse específico e fazer as mudanças necessárias para os procedimentos descritos.
Dado o recente desenvolvimento de métodos de proteômica quantitativos, há muitos a escolher de ao selecionar o método mais eficiente para uma experiência particular. Entre eles estão os iTRAQ com base química (marcas isobáricos para a quantificação relativa e absoluta) 8 eo MRM livre-label (monitoramento de reações múltiplas) 9 técnicas. Ambos os métodos são ferramentas poderosas e são boas opções para configurações específicas. Para um laboratório típico trabalhando principalmente com linhas celulares, no entanto, estes dois métodos têm relativelY custos mais elevados e são mais demorado quando comparado com o método baseado SILAC. SILAC é uma técnica de marcação metabólica com base que incorpora formas isotópicas de aminoácidos não radioactivos de meios de cultura para as proteínas celulares. Tipicamente, as experiências SILAC começar com duas populações de células, por exemplo, infectados e não infectados. Cada um está marcado diferencialmente em seu ambiente isotópica específica até rotulagem completa seja alcançada. Os exossomas marcados destas células são então submetidas a extracção de proteínas. Uma vez extraído, as proteínas marcadas são exosomal analisadas utilizando espectrometria de massa em tandem com cromatograf ia líquida 10. Finalmente, os resultados de espectrometria de massa e as proteínas marcadas são significativamente submetido a análise estatística e bioinformática, bem como para a verificação bioquímica rigorosa. Nossos relatórios de investigação anteriores sugerem que os procedimentos SILAC / exossomo são mais apropriadas para linhas de células do que as células primárias, como linhas celulares são geralmente em umestado de proliferação ativa de marcação isotópica eficiente,
Protocol
Representative Results
Discussion
Nos procedimentos descritos no presente documento, demonstramos a aplicação da técnica SILAC para investigar o efeito de infecção por HIV-1 no proteoma exosomal hospedeiro. Inicialmente, as células infectadas e não infectadas com HIV-1 são diferencialmente marcado com isótopo. Os exossomas marcados diferencialmente são então purificados antes de realizar a extracção de proteínas. Em seguida, a espectrometria de massa em tandem com cromatograf ia líquida é utilizada para analisar o proteoma exosomal. Fina…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por um suplemento de ARRA ao tempo de vida / Tufts / Brown CFAR, P30AI042853-13S1, NIH P20GM103421, P01AA019072, R01HD072693 e K24HD080539 a BR. Este trabalho também foi apoiado por expectativa de vida Fundo Pilot Research (# 701- 5857), Rhode Island Medical Foundation Grant Research (# 20.133.969) e NIH COBRE URI / RIH Pilot Research Grant (P20GM104317) para ML. Agradecemos James Myall e Vy Dang para obter ajuda com a preparação do manuscrito e figura.
Materials
| H9 cell line | ATCC | HTB-176 | |
| Trypan Blue | Thermo Fisher | 15250061 | |
| MTT assay kit | Thermo Fisher | V13154 | |
| Dialyzed fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher | 26400044 | |
| SILAC Protein Quantitation Kit – RPMI 1640 | Thermo Fisher | 89982 | DMEM version (89983) |
| L-Arginine-HCl, 13C6, 15N4 for SILAC | Thermo Fisher | 88434 | |
| L-Lysine-2HCl, 13C6 for SILAC | Thermo Fisher | 88431 | |
| HIV-1NL4-3 | NIH AIDS Reagent Program | 2480 | |
| Alliance HIV-1 p24 Antigen ELISA kit | PerkinElmer | NEK050001KT | |
| Refrigerated super-speed centrifuge | Eppendorf | 22628045 | |
| Refrigerated ultracentrifuge | Beckman Coulter | 363118 | Should be able to reach 100,000g |
| 50mL Conical Centrifuge Tubes | Thermo Fisher | 14-432-22 | |
| Ultracentrifuge Tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
| SW 32 Ti Rotor | Beckman Coulter | 369694 | |
| RIPA buffer | Thermo Fisher | 89900 | |
| Protease Inhibitor Cocktails | Thermo Fisher | 78430 | |
| ThermoMixer | Eppendorf | 5384000020 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher | 23250 | |
| Spectrophotometer | Biorad | 1702525 | |
| SDS PAGE Gel apparatus | Thermo Fisher | EI0001 | |
| Novex 4-20% Tris-Glycine Mini Gels | Novex | XV04200PK20 | |
| Gel staining reagent | Sigma Aldrich | G1041 | |
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | |
| SpeedVac Concentrator | Thermo Fisher | SPD131DDA | |
| Antibody to human annexin A5 | Abcam | ab14196 | |
| Antibody to human lactate dehydrogenase B chain | Abcam | ab53292 | |
| Graphing and Statistical Software | Systat | SigmaPlot | Or GraphPad Prism |
| Quantitative proteomics software suite | Max Planck Institue of Biochemistry | Maxquant | |
| Software and databases | Various vendors | Refer to main text for details |
References
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