SILAC Based Proteoom karakterisatie van exosomen van HIV-1 geïnfecteerde cellen
Summary
We beschrijven een kwantitatieve proteomics met gebruik van technieken van stabiele isotopen van aminozuren in celcultuur (SILAC) het effect van HIV-1 infectie op host exosomaal proteoom analyse. Dit protocol kan gemakkelijk worden aangepast aan cellen onder verschillende stress of infectie omstandigheden.
Abstract
Proteomics is the large-scale analysis of proteins. Proteomic techniques, such as liquid chromatography tandem mass spectroscopy (LC-MS/MS), can characterize thousands of proteins at a time. These powerful techniques allow us to have a systemic understanding of cellular changes, especially when cells are subjected to various stimuli, such as infections, stresses, and specific test conditions. Even with recent developments, analyzing the exosomal proteome is time-consuming and often involves complex methodologies. In addition, the resultant large dataset often needs robust and streamlined analysis in order for researchers to perform further downstream studies. Here, we describe a SILAC-based protocol for characterizing the exosomal proteome when cells are infected with HIV-1. The method is based on simple isotope labeling, isolation of exosomes from differentially labeled cells, and mass spectrometry analysis. This is followed by detailed data mining and bioinformatics analysis of the proteomic hits. The resultant datasets and candidates are easy to understand and often offer a wealth of information that is useful for downstream analysis. This protocol is applicable to other subcellular compartments and a wide range of test conditions.
Introduction
Veel menselijke ziekten, waaronder virusinfecties, vaak geassocieerd met kenmerkende cellulaire processen die plaatsvinden in en rond de aangetaste cellen. Eiwitten, die vaak optreedt als de ultieme mobiele effectoren, bemiddelen deze processen. Analyse van de eiwitten vaak waardevolle informatie verschaffen over de lokale omgeving van betrokken cellen en helpen om het onderliggende mechanisme van de pathogenese van de ziekte te begrijpen. Tussen de verschillende eiwitanalyse technieken, proteomics houdt bijzonder grote belofte. Als krachtige, grootschalige gereedschap kan proteomics systemische begrip van cellulaire processen, met name op het gebied van de functie en interactie van eiwitten. Analyseren eiwitten wordt eenvoudiger gemaakt door de ontwikkeling van labeling technieken, waarmee onderzoekers om de expressie van cellulaire componenten, met name eiwitten controleren, in de plaats van onderzoek. Hoewel veel proteomics analyses zijn uitgevoerd op cellulairproteoom schaal, proteomics karakteriseringen op subcellulaire compartimenten bleek bijzonder informatief 1 te zijn. Dit wordt goed geïllustreerd in de studies van HIV-1 infectie.
Exosomes, 30-100 nm membraanblaasjes afgescheiden door een groot aantal celtypen 2, 3, zijn kritische componenten van intercellulaire communicatie en moleculair transport. Ze werden eerder ontdekte belangrijke rol spelen in de HIV-1 ontluikende werkwijze 4, 5. Door het combineren proteoomanalyse met functionele dissectie, vonden we dat exosomes vrijkomt uit HIV-1 geïnfecteerde cellen bestaan uit een unieke en kwantitatief andere handtekening en haven eiwit regulerende moleculen die cellulaire eigenschappen beïnvloeden naburige ontvankelijke cellen, inclusief cellulaire apoptose en proliferatie 6. De methoden worden beschreven in dit protocol,namelijk SILAC (stabiele isotoop labeling van aminozuren in celcultuur) 7 op basis van proteomics karakterisering van exosomes van HIV-1 geïnfecteerde cellen. Soortgelijke benaderingen kunnen worden toegepast om beter inzicht andere subcellulaire compartimenten tijdens pathogenese door het aanpassen van de experimentele belasting van de specifieke compartiment of gedeelte plaats en een aantal wijzigingen aan de beschreven procedures.
Gezien de recente ontwikkeling van kwantitatieve proteomics methoden, zijn er veel te kiezen bij het selecteren van de meest efficiënte methode voor een bepaald experiment. Voorbeelden hiervan zijn de chemische basis iTRAQ (isobarisch tags voor relatieve en absolute kwantificatie) 8 en het label-free MRM (meerdere reactie monitoring) 9 technieken. Beide methoden zijn krachtige tools en zijn goede keuzes voor specifieke instellingen. Voor een typische laboratorium vooral bezig met cellijnen, maar deze twee methoden relatively hogere kosten en meer tijdrovend in vergelijking met de SILAC gebaseerde methode. SILAC is een metabole gebaseerde labeling techniek die radioactieve isotopische vormen van aminozuren uit het kweekmedium in cellulaire eiwitten bevat. Gewoonlijk SILAC experimenten beginnen met twee celpopulaties, bijvoorbeeld geïnfecteerde en ongeïnfecteerde. Elke kamer is verschillend gemerkte in zijn specifieke isotoop omgeving tot volledige etikettering is bereikt. De gelabelde exosomes van deze cellen worden vervolgens onderworpen aan proteïne extractie. Eenmaal geëxtraheerd, de gelabelde exosomaal eiwitten worden geanalyseerd met vloeistofchromatografie tandem 10 massaspectroscopie. Tenslotte de massaspectrometrie resultaten en significant gemerkte eiwitten worden onderworpen aan statistische en bioinformatica analyses en biochemische strenge controle. Onze eerdere onderzoeksrapporten suggereren dat de SILAC / exosome procedures geschikter voor cellijnen van primaire cellen, cellijnen zijn gewoonlijk peractief prolifererende staat voor een efficiënte isotopische labeling,
Protocol
Representative Results
Discussion
In de in dit artikel beschreven procedures, we aangetoond dat de toepassing van de SILAC techniek om het effect van HIV-1 infectie bij de gastheer exosomaal proteoom onderzoeken. Aanvankelijk geïnfecteerde en HIV-1 geïnfecteerde cellen verschillend isotoop gemerkte. De verschillend gemerkte exosomes worden vervolgens gezuiverd voordat eiwitextractie. Vervolgens wordt vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie gebruikt om de exosomaal proteoom analyse. Ten slotte is de resulterende massa spectrometrie gegevens e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door een ARRA aanvulling op de levensduur / Tufts / Brown CFAR, P30AI042853-13S1, NIH P20GM103421, P01AA019072, R01HD072693 en K24HD080539 tot BR. Dit werk werd ook gesteund door Levensduur Pilot Research Fund (# 701- 5857), Rhode Island Stichting Medical Research Grant (# 20.133.969), en NIH COBRE URI / RIH Pilot Research Grant (P20GM104317) naar ML. Wij danken James Myall en Vy Dang voor hulp bij het manuscript en figuur voorbereiding.
Materials
| H9 cell line | ATCC | HTB-176 | |
| Trypan Blue | Thermo Fisher | 15250061 | |
| MTT assay kit | Thermo Fisher | V13154 | |
| Dialyzed fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher | 26400044 | |
| SILAC Protein Quantitation Kit – RPMI 1640 | Thermo Fisher | 89982 | DMEM version (89983) |
| L-Arginine-HCl, 13C6, 15N4 for SILAC | Thermo Fisher | 88434 | |
| L-Lysine-2HCl, 13C6 for SILAC | Thermo Fisher | 88431 | |
| HIV-1NL4-3 | NIH AIDS Reagent Program | 2480 | |
| Alliance HIV-1 p24 Antigen ELISA kit | PerkinElmer | NEK050001KT | |
| Refrigerated super-speed centrifuge | Eppendorf | 22628045 | |
| Refrigerated ultracentrifuge | Beckman Coulter | 363118 | Should be able to reach 100,000g |
| 50mL Conical Centrifuge Tubes | Thermo Fisher | 14-432-22 | |
| Ultracentrifuge Tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
| SW 32 Ti Rotor | Beckman Coulter | 369694 | |
| RIPA buffer | Thermo Fisher | 89900 | |
| Protease Inhibitor Cocktails | Thermo Fisher | 78430 | |
| ThermoMixer | Eppendorf | 5384000020 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher | 23250 | |
| Spectrophotometer | Biorad | 1702525 | |
| SDS PAGE Gel apparatus | Thermo Fisher | EI0001 | |
| Novex 4-20% Tris-Glycine Mini Gels | Novex | XV04200PK20 | |
| Gel staining reagent | Sigma Aldrich | G1041 | |
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | |
| SpeedVac Concentrator | Thermo Fisher | SPD131DDA | |
| Antibody to human annexin A5 | Abcam | ab14196 | |
| Antibody to human lactate dehydrogenase B chain | Abcam | ab53292 | |
| Graphing and Statistical Software | Systat | SigmaPlot | Or GraphPad Prism |
| Quantitative proteomics software suite | Max Planck Institue of Biochemistry | Maxquant | |
| Software and databases | Various vendors | Refer to main text for details |
References
- Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (8), 968-977 (2016).
- Schorey, J. S., Bhatnagar, S. Exosome function: from tumor immunology to pathogen biology. Traffic. 9 (6), 871-881 (2008).
- Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat Rev Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).
- Booth, A. M., et al. Exosomes and HIV Gag bud from endosome-like domains of the T cell plasma membrane. J Cell Biol. 172 (6), 923-935 (2006).
- Van Engelenburg, S. B., et al. Distribution of ESCRT machinery at HIV assembly sites reveals virus scaffolding of ESCRT subunits. Science. 343 (6171), 653-656 (2014).
- Li, M., et al. Quantitative proteomic analysis of exosomes from HIV-1-infected lymphocytic cells. Proteomics. 12 (13), 2203-2211 (2012).
- Ong, S. E., et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Mol Cell Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
- Ross, P. L., et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).
- Anderson, L., Hunter, C. L. Quantitative mass spectrometric multiple reaction monitoring assays for major plasma proteins. Mol Cell Proteomics. 5 (4), 573-588 (2006).
- Ong, S. E., Mann, M. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture for quantitative proteomics. Methods Mol Biol. 359, 37-52 (2007).
- Strober, W. . Current Protocols in Immunology. , (2001).
- Verma, A., et al. Evaluation of the MTT lymphocyte proliferation assay for the diagnosis of neurocysticercosis. J Microbiol Meth. 81 (2), 175-178 (2010).
- Cepko, C., Pear, W. Retrovirus infection of cells in vitro and in vivo. Curr Protoc Mol Biol. , (2001).
- Lennette, E. T., Karpatkin, S., Levy, J. A. Indirect immunofluorescence assay for antibodies to human immunodeficiency virus. J Clin Microbiol. 25 (2), 199-202 (1987).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , 22 (2006).
- Olson, B. J. S. C., Markwell, J. . Current Protocols in Protein Science. , (2001).
- Gauci, V. J., Padula, M. P., Coorssen, J. R. Coomassie blue staining for high sensitivity gel-based proteomics. J Proteom. 90, 96-106 (2013).
- Soldi, M., Bonaldi, T. The ChroP approach combines ChIP and mass spectrometry to dissect locus-specific proteomic landscapes of chromatin. J Vis Exp. (86), (2014).
- Trompelt, K., Steinbeck, J., Terashima, M., Hippler, M. A new approach for the comparative analysis of multiprotein complexes based on 15N metabolic labeling and quantitative mass spectrometry. J Vis Exp. (85), (2014).
- Li, M., et al. Stem-loop binding protein is a multifaceted cellular regulator of HIV-1 replication. J Clin Invest. 126 (8), 3117-3129 (2016).
- Li, M., Ramratnam, B. Proteomic Characterization of Exosomes from HIV-1-Infected Cells. Methods Mol Biol. 1354, 311-326 (2016).
- Emmott, E., Goodfellow, I. Identification of protein interaction partners in mammalian cells using SILAC-immunoprecipitation quantitative proteomics. J Vis Exp. (89), (2014).
- Keerthikumar, S., et al. ExoCarta: A Web-Based Compendium of Exosomal Cargo. J Mol Biol. 428 (4), 688-692 (2016).
- Kim, D. K., et al. EVpedia: a community web portal for extracellular vesicles research. Bioinformatics. 31 (6), 933-939 (2015).
- Fu, W., et al. Human immunodeficiency virus type 1, human protein interaction database at NCBI. Nucleic Acids Res. 37, 417-422 (2009).
- Pathan, M., et al. FunRich: An open access standalone functional enrichment and interaction network analysis tool. Proteomics. 15 (15), 2597-2601 (2015).
- Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat Protoc. 4 (1), 44-57 (2009).
- Szklarczyk, D., et al. The STRING database in 2011: functional interaction networks of proteins, globally integrated and scored. Nucleic Acids Res. 39, 561-568 (2011).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , (2006).
- Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27031 (2015).
- Webber, J., Clayton, A. How pure are your vesicles. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
- Cantin, R., Diou, J., Belanger, D., Tremblay, A. M., Gilbert, C. Discrimination between exosomes and HIV-1: purification of both vesicles from cell-free supernatants. J Immunol Methods. 338 (1-2), 21-30 (2008).
- Chertova, E., et al. Proteomic and biochemical analysis of purified human immunodeficiency virus type 1 produced from infected monocyte-derived macrophages. J Virol. 80 (18), 9039-9052 (2006).
- Nikolov, M., Schmidt, C., Urlaub, H. Quantitative mass spectrometry-based proteomics: an overview. Methods Mol Biol. 893, 85-100 (2012).
