SILAC القائم [بروتيوميك توصيف Exosomes من HIV-1 الخلايا المصابة
Summary
هنا، نحن تصف طريقة البروتينات الكمي باستخدام تقنية مستقرة وصفها النظائر عن طريق الأحماض الأمينية في ثقافة الخلية (SILAC) لتحليل آثار عدوى HIV-1 على proteomes exosomal المضيف. هذا البروتوكول يمكن تكييفها بسهولة إلى الخلايا تحت مختلف الإجهاد أو الإصابة الظروف.
Abstract
Proteomics is the large-scale analysis of proteins. Proteomic techniques, such as liquid chromatography tandem mass spectroscopy (LC-MS/MS), can characterize thousands of proteins at a time. These powerful techniques allow us to have a systemic understanding of cellular changes, especially when cells are subjected to various stimuli, such as infections, stresses, and specific test conditions. Even with recent developments, analyzing the exosomal proteome is time-consuming and often involves complex methodologies. In addition, the resultant large dataset often needs robust and streamlined analysis in order for researchers to perform further downstream studies. Here, we describe a SILAC-based protocol for characterizing the exosomal proteome when cells are infected with HIV-1. The method is based on simple isotope labeling, isolation of exosomes from differentially labeled cells, and mass spectrometry analysis. This is followed by detailed data mining and bioinformatics analysis of the proteomic hits. The resultant datasets and candidates are easy to understand and often offer a wealth of information that is useful for downstream analysis. This protocol is applicable to other subcellular compartments and a wide range of test conditions.
Introduction
العديد من الأمراض التي تصيب الإنسان، بما في ذلك العدوى الفيروسية، غالبا ما ترتبط مع العمليات الخلوية المميزة التي تحدث في وحول الخلايا المتضررة. والبروتينات، وغالبا ما يتصرف مثل مؤثرات الخلوية في نهاية المطاف، توسط هذه العمليات. تحليل البروتينات في كثير من الأحيان يمكن أن توفر معلومات لا تقدر بثمن بالنسبة للبيئة المحلية من الخلايا المتضررة وتساعدنا على فهم آلية الكامنة وراء المرض والتسبب. بين مختلف تقنيات تحليل البروتين والبروتينات واعدة للغاية بشكل خاص. كما قوية، أداة واسعة النطاق، يمكن أن البروتينات توفير فهم النظامية من العمليات الخلوية، وخاصة في مجال الوظيفة وتفاعل البروتينات. تحليل بروتينات معينة يتم بساطة من خلال تطوير تقنيات وضع العلامات، والتي تسمح للمحققين لمراقبة تعبير عن المكونات الخلوية، وخاصة البروتينات، في موقع التحقيق. وعلى الرغم من تنفيذ العديد من التحليلات البروتين في الخلويوقد ثبت على نطاق وبروتيوم، الأوصاف البروتين في المقصورات التحت خلوية أن تكون مفيدة بشكل خاص 1. ويتمثل هذا جيدا في دراسات عدوى HIV-1.
Exosomes، 30-100 حويصلات غشاء نانومتر التي يفرزها مجموعة واسعة من أنواع الخلايا 2، 3، مكونات حاسمة في التواصل بين الخلايا والنقل الجزيئي. تم اكتشافها سابقا للعب أدوار مهمة في HIV-1 في مهدها عملية 4، 5. من خلال الجمع بين تحليل البروتين مع تشريح وظيفي، وجدنا أن exosomes صدر من HIV-1 الخلايا المصابة وتتكون من توقيع البروتين والجزيئات ميناء تنظيمية فريدة ومختلفة من الناحية الكمية التي تؤثر الخصائص الخلوية على الخلايا الاستقبالية، بما في ذلك الخلايا الخلوية وانتشار 6 المجاورة. ووصف الأساليب في هذا البروتوكول،وهي SILAC (نظير مستقر وصفها من قبل الأحماض الأمينية في ثقافة الخلية) 7 استنادا توصيف البروتين من exosomes من HIV-1 الخلايا المصابة. نهج مماثلة يمكن تطبيقها على فهم أفضل المقصورات التحت خلوية أخرى خلال التسبب عن طريق ضبط الضغط التجريبي إلى المقصورة أو جزء من الفائدة محددة وإجراء التغييرات اللازمة للإجراءات وصفها.
وبالنظر إلى التطورات الأخيرة في طرق البروتين الكمي، وهناك الكثير للاختيار من بينها عند اختيار الأسلوب الأكثر فعالية لإجراء تجربة معينة. ومن بين هذه iTRAQ القائمة على المواد الكيميائية (العلامات إسوي الضغط لتقدير النسبي والمطلق) (8) وMRM خالية من التسمية (مراقبة رد فعل متعددة) 9 التقنيات. كلتا الطريقتين هي أدوات قوية وهي خيارات جيدة لإعدادات محددة. لمختبر نموذجي يعمل أساسا مع خطوط الخلايا، ومع ذلك، وهذه الأساليب لهما relativelذ ارتفاع التكاليف وأكثر بالمقارنة مع طريقة تقوم SILAC تستغرق وقتا طويلا. SILAC هو التمثيل الغذائي القائم العلامات التقنية التي تتضمن أشكال النظائر امشع من الأحماض الأمينية من وسائل الإعلام الثقافة في البروتينات الخلوية. عادة، والتجارب SILAC تبدأ مع اثنين من سكان الخلية، على سبيل المثال، المصابة وغير المصابة. كل وصفت بشكل مختلف في بيئة النظائر محددة إلى حين التوصل إلى وضع علامات كاملة. ثم يتعرض للexosomes وصفت هذه الخلايا لاستخراج البروتين. مرة واحدة المستخرج، ويتم تحليل البروتينات exosomal المسمى باستخدام السائل اللوني جنبا إلى جنب الكتلة الطيفي 10. وأخيرا، يتعرض نتائج مطياف الكتلة والبروتينات وصفت بشكل كبير في الإحصائية والمعلوماتية الحيوية ويحلل وكذلك التحقق الكيمياء الحيوية صارم. وتشير تقاريرنا التحقيق السابقة أن الإجراءات SILAC / exosome أكثر ملاءمة للخطوط الخلايا من الخلايا الأولية، وخطوط الخلايا وعادة ما تكون فيالدولة المتكاثرة نشطة لكفاءة وضع العلامات النظائر،
Protocol
Representative Results
Discussion
في الإجراءات الموضحة في هذه الورقة، أثبتنا تطبيق تقنية SILAC لدراسة تأثير الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية 1 على بروتيوم exosomal المضيف. في البداية، الخلايا المصابة غير المصابة وHIV-1 هي تفاضلي المسمى النظير. ثم يتم تنقيته من exosomes المسمى تفاضلي قبل تنفيذ استخراج البروتين….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل الملحق الأذربيجانية إلى عمر / تافتس / براون CFAR، P30AI042853-13S1، المعاهد الوطنية للصحة P20GM103421، P01AA019072، R01HD072693، وK24HD080539 إلى BR. وأيد هذا العمل أيضا من قبل صندوق عمر الطيار البحوث (# 701- 5857)، رود ايلاند مؤسسة أبحاث الطبية غرانت (# 20133969)، والمعاهد الوطنية للصحة كوبر أوري / RIH الطيار منحة بحثية (P20GM104317) لML. نشكر جيمس Myall وVY دانغ للمساعدة في إعداد المخطوط والشكل.
Materials
| H9 cell line | ATCC | HTB-176 | |
| Trypan Blue | Thermo Fisher | 15250061 | |
| MTT assay kit | Thermo Fisher | V13154 | |
| Dialyzed fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher | 26400044 | |
| SILAC Protein Quantitation Kit – RPMI 1640 | Thermo Fisher | 89982 | DMEM version (89983) |
| L-Arginine-HCl, 13C6, 15N4 for SILAC | Thermo Fisher | 88434 | |
| L-Lysine-2HCl, 13C6 for SILAC | Thermo Fisher | 88431 | |
| HIV-1NL4-3 | NIH AIDS Reagent Program | 2480 | |
| Alliance HIV-1 p24 Antigen ELISA kit | PerkinElmer | NEK050001KT | |
| Refrigerated super-speed centrifuge | Eppendorf | 22628045 | |
| Refrigerated ultracentrifuge | Beckman Coulter | 363118 | Should be able to reach 100,000g |
| 50mL Conical Centrifuge Tubes | Thermo Fisher | 14-432-22 | |
| Ultracentrifuge Tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
| SW 32 Ti Rotor | Beckman Coulter | 369694 | |
| RIPA buffer | Thermo Fisher | 89900 | |
| Protease Inhibitor Cocktails | Thermo Fisher | 78430 | |
| ThermoMixer | Eppendorf | 5384000020 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher | 23250 | |
| Spectrophotometer | Biorad | 1702525 | |
| SDS PAGE Gel apparatus | Thermo Fisher | EI0001 | |
| Novex 4-20% Tris-Glycine Mini Gels | Novex | XV04200PK20 | |
| Gel staining reagent | Sigma Aldrich | G1041 | |
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | |
| SpeedVac Concentrator | Thermo Fisher | SPD131DDA | |
| Antibody to human annexin A5 | Abcam | ab14196 | |
| Antibody to human lactate dehydrogenase B chain | Abcam | ab53292 | |
| Graphing and Statistical Software | Systat | SigmaPlot | Or GraphPad Prism |
| Quantitative proteomics software suite | Max Planck Institue of Biochemistry | Maxquant | |
| Software and databases | Various vendors | Refer to main text for details |
References
- Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (8), 968-977 (2016).
- Schorey, J. S., Bhatnagar, S. Exosome function: from tumor immunology to pathogen biology. Traffic. 9 (6), 871-881 (2008).
- Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat Rev Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).
- Booth, A. M., et al. Exosomes and HIV Gag bud from endosome-like domains of the T cell plasma membrane. J Cell Biol. 172 (6), 923-935 (2006).
- Van Engelenburg, S. B., et al. Distribution of ESCRT machinery at HIV assembly sites reveals virus scaffolding of ESCRT subunits. Science. 343 (6171), 653-656 (2014).
- Li, M., et al. Quantitative proteomic analysis of exosomes from HIV-1-infected lymphocytic cells. Proteomics. 12 (13), 2203-2211 (2012).
- Ong, S. E., et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Mol Cell Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
- Ross, P. L., et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).
- Anderson, L., Hunter, C. L. Quantitative mass spectrometric multiple reaction monitoring assays for major plasma proteins. Mol Cell Proteomics. 5 (4), 573-588 (2006).
- Ong, S. E., Mann, M. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture for quantitative proteomics. Methods Mol Biol. 359, 37-52 (2007).
- Strober, W. . Current Protocols in Immunology. , (2001).
- Verma, A., et al. Evaluation of the MTT lymphocyte proliferation assay for the diagnosis of neurocysticercosis. J Microbiol Meth. 81 (2), 175-178 (2010).
- Cepko, C., Pear, W. Retrovirus infection of cells in vitro and in vivo. Curr Protoc Mol Biol. , (2001).
- Lennette, E. T., Karpatkin, S., Levy, J. A. Indirect immunofluorescence assay for antibodies to human immunodeficiency virus. J Clin Microbiol. 25 (2), 199-202 (1987).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , 22 (2006).
- Olson, B. J. S. C., Markwell, J. . Current Protocols in Protein Science. , (2001).
- Gauci, V. J., Padula, M. P., Coorssen, J. R. Coomassie blue staining for high sensitivity gel-based proteomics. J Proteom. 90, 96-106 (2013).
- Soldi, M., Bonaldi, T. The ChroP approach combines ChIP and mass spectrometry to dissect locus-specific proteomic landscapes of chromatin. J Vis Exp. (86), (2014).
- Trompelt, K., Steinbeck, J., Terashima, M., Hippler, M. A new approach for the comparative analysis of multiprotein complexes based on 15N metabolic labeling and quantitative mass spectrometry. J Vis Exp. (85), (2014).
- Li, M., et al. Stem-loop binding protein is a multifaceted cellular regulator of HIV-1 replication. J Clin Invest. 126 (8), 3117-3129 (2016).
- Li, M., Ramratnam, B. Proteomic Characterization of Exosomes from HIV-1-Infected Cells. Methods Mol Biol. 1354, 311-326 (2016).
- Emmott, E., Goodfellow, I. Identification of protein interaction partners in mammalian cells using SILAC-immunoprecipitation quantitative proteomics. J Vis Exp. (89), (2014).
- Keerthikumar, S., et al. ExoCarta: A Web-Based Compendium of Exosomal Cargo. J Mol Biol. 428 (4), 688-692 (2016).
- Kim, D. K., et al. EVpedia: a community web portal for extracellular vesicles research. Bioinformatics. 31 (6), 933-939 (2015).
- Fu, W., et al. Human immunodeficiency virus type 1, human protein interaction database at NCBI. Nucleic Acids Res. 37, 417-422 (2009).
- Pathan, M., et al. FunRich: An open access standalone functional enrichment and interaction network analysis tool. Proteomics. 15 (15), 2597-2601 (2015).
- Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat Protoc. 4 (1), 44-57 (2009).
- Szklarczyk, D., et al. The STRING database in 2011: functional interaction networks of proteins, globally integrated and scored. Nucleic Acids Res. 39, 561-568 (2011).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , (2006).
- Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27031 (2015).
- Webber, J., Clayton, A. How pure are your vesicles. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
- Cantin, R., Diou, J., Belanger, D., Tremblay, A. M., Gilbert, C. Discrimination between exosomes and HIV-1: purification of both vesicles from cell-free supernatants. J Immunol Methods. 338 (1-2), 21-30 (2008).
- Chertova, E., et al. Proteomic and biochemical analysis of purified human immunodeficiency virus type 1 produced from infected monocyte-derived macrophages. J Virol. 80 (18), 9039-9052 (2006).
- Nikolov, M., Schmidt, C., Urlaub, H. Quantitative mass spectrometry-based proteomics: an overview. Methods Mol Biol. 893, 85-100 (2012).
