Bu yazıda, mevcut bir TCR'nin TCRα ya TCRβ eşleştirme periferal T hücresi reseptör repertuvarının tamamlayıcı hemichain ile, ilgi konusu antijen spesifikliğini sahip antijen-spesifik T hücre reseptörleri (TCR'ler) oluşturmak için yeni bir metot açıklamaktadır. De novo oluşturulan TCRler afiniteye değişen antijen spesifikliğini muhafaza eder.
T hücre reseptörleri (TCR'ler) immünoterapi gelecek vaat eden bir yöntem olarak tümör hedef T hücrelerinin özgüllük doğrudan klinikte kullanılmaktadır. Bu nedenle, çeşitli tümörle birleşmiş antijenler için spesifik klonlama TCRler birçok çalışma hedefi olmuştur. etkili bir T hücresi tepkisi ortaya çıkarmak için, TCR uygun afinite ile hedef antijeni tanımalıdır. Ancak, klonlama gibi TCR'ler bir meydan okuma ve birçok kullanılabilir TCR'ler olmuştur soydaş antijen sub-optimal yakınlığa sahip olmuştur. Bu protokol, hemichain flubelerde yararlanarak mevcut TCRler kullanılarak de novo, yüksek afinite antijen spesifik TCRlerin klonlanması için bir yöntem tarif eder. Bazı TCRler için, her TCRα ya TCRβ hemichain antijen tanınması eşit katkı anlaşılana ve baskın hemichain merkezli hemichain olarak adlandırılır. Biz orijinal karşı zincirinden farklı karşıt zincirleri ile merkezli hemichain eşleştirme, biz antijen s korumak mümkün olduğunu göstermiştirpecificity, aynı kökenli bir antijen için etkileşimi gücünü modüle ederken. Bu nedenle, belirli bir TCR'nin terapötik potansiyeli merkezli ve karşı hemichains arasında eşleşmeye optimize ederek arttırılabilir.
T hücre reseptörleri (TCR'ler) bir TCRα ve TCRβ zinciri oluşan T lenfositler tarafından ifade heterodimerik adaptif bağışıklık reseptörleri vardır. Onlar HLA / peptit kompleksleri neredeyse sınırsız yapılandırmaları tanıyabilen oldukça çeşitli bir repertuar üreten V (D) J gen segmentlerinin, somatik düzenlenmesi yoluyla oluşturulur. Klinik olarak, tümörle birleşmiş antijenler için clonotypic TCR'ler spesifik ifade etmek üzere geliştirilen T hücreleri kanser 1 çeşitli etkinliğini göstermiştir. Bununla birlikte, bu amaç için klonlanmış bir çok TCRler terapötik uygulama sınırlayan ilgili antijen için yeterlidir afiniteye sahip değildir.
Burada, zincir merkezlilik yararlanarak mevcut TCRler için bu sınırlamayı aşmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu bir TCR hemichain hedef antijenin 2 tanınması daha baskın bir rol oynayabileceğini rapor edilmiştir, burada flubelerde olarak adlandırılan. Kristal yapı analizleri bu bir Centric göstermiştirBir TCR hemichain 3,4 karmaşık MHC / peptit üzerinde ayak izi çoğunluğu için hesap verebilir. Bu kavram kullanılarak, daha önce SIG35α TCRα TCRβ zincirlerinin farklı bir repertuar ile eşleşmeye ve HLA-A2 tarafından sunulan 5 MART1 27-35 peptide karşı reaktiflik muhafaza olduğunu göstermiştir. Benzer sonuçlar merkezli TCRβ hemichain çeşitli TCRα zincirleri ile eşleştirilmiş ve HLA-A24 6 tarafından sunulan WT1 235-243 peptit için reaktivite muhafaza TAK1 TCR ile elde edilmiştir. MART1 ve WT1 Hem tümör bağlantılı antijenler vardır. Zincir merkezlilik farklı Vβ11 TCRβ zincirleri 7 insan iNKT TCRlerin değişmeyen Vα24-Jα18 (Vα24i) TCRα zinciri eşleyerek, CD1d kısıtlamalı değişmeyen Doğal Katil (iNKT) TCRlerin antijen tanıma çalışma uygulanmıştır.
Tüm durumlarda, trans göre TCRlerin de novo repertuarı üretmek mümkünkişiye hemichain endojen TCRα ya TCRβ karşı zincirleri ile eşleştirilmiş periferal kan T-hücreleri, merkezli TCR hemichain ducing. Aslında, merkezi hemichain birlikte eşleştirilmiş ilgi antijen özelliği muhafaza TCRlerin oluşturur, ancak afinite değişen uygun bir karşı-zincirleri, belirlemek için kullanılabilecek bir yem olarak hizmet vermektedir. Bu yeni repertuarların, biz önceden varolan TCRler göre hedef antijene karşı iyileştirilmiş bir karşılıklı etkileşim gücü olan clonotypic TCRlerin izole mümkün. Bu nedenle, bu yöntemin klinik uygulama için en uygun TCRler belirlenmesi boru hattı hızlandıracak inanıyorum.
Bu yöntemin başarılı bir uygulama için ilk şartı ilgi hemichain birincil T hücrelerinin yeterli transdüksiyon verimliliği elde edilir. Deneyimlerimize göre, insan primer T hücrelerinde, katılan genin kararlı ve etkili ekspresyonu için retroviral vektör sonuçları gibi paketleme hücre hattı ve Pmx olarak PG13 kullanarak kombinasyon halinde. PG13 paketleme hücreleri transdüksiyon verimliliği artırmak için, yüksek titre ambalaj hücreleri seçmek için klonlanmış tek hücre olabilir. Bundan başk…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by NIH grant R01 CA148673 (NH); the Ontario Institute for Cancer Research Clinical Investigator Award IA-039 (NH); BioCanRX Catalyst Grant (NH); The Princess Margaret Cancer Foundation (MOB, NH); Canadian Institutes of Health Research Canada Graduate Scholarship (TG); Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Postgraduate Scholarship (TG); Province of Ontario (TG, MA); and Guglietti Fellowship Award (TO). HLA and CD1d monomers were kindly provided by the NIH tetramer core facility.
0.05% Trypsin-EDTA | Wisent Bioproducts | 325-043-CL | |
293GPG cells | Generated by Ory et al. (ref 8) | ||
Agar | Wisent Bioproducts | 800-010-CG | |
Agarose | Wisent Bioproducts | 800-015-CG | |
Ampicillin sodium salt | Wisent Bioproducts | 400-110-IG | |
Chloroform | BioShop | CCL402 | |
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix | New England Biolabs | N0447L | |
DMEM, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 11995065 | |
EcoRI | New England Biolabs | R0101S | |
EZ-10 Spin Column DNA Gel Extraction Kit | BS353 | ||
Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 12483020 | |
Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
Filter | Corning | 431220 | 0.45 mm pore SFCA membrane |
FITC-conjugated anti-human CD271 (NGFR) mAb | Biolegend | 345104 | clone ME20.4 |
FITC-conjugated anti-human CD3 mAb | Biolegend | 300440 | clone UCHT1 |
Gentamicin | Life Technologies | 15750078 | |
Gibson Assembly Master Mix | New England Biolabs | E2611L | used for multi-piece DNA assembly |
HLA-A2 pentamer | Proimmune | depends on antigenic peptide | HLA-A2/MART1 multimer used here was purchased from Proimmune |
HLA/CD1d monomers | NIH Tetramer Core Facility | multimerize monomers according to protocol provided by NIH tetramer core facility | |
Human AB serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
human CD3 microbeads | Miltenyi Biotec | 130-050-101 | |
IOTest Beta Mark TCR V beta Repertoire Kit | Beckman Coulter | IM3497 | |
Jurkat 76 cells | Generated by Heemskerk et al. (ref 10) | ||
LB Broth | Wisent Bioproducts | 800-060-LG | |
LS MACS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
NEB 5-alpha Competent E. coli | New England Biolabs | C2987I | |
NEBuffer 3.1 | New England Biolabs | B7203S | used for EcoRI and NotI digestion |
NotI | New England Biolabs | R0189S | |
NucleoBond Xtra Midi | Macherey-Nagel | 740410 | used for plasmid purification |
PC5-conjugated anti-human CD8 mAb | Beckman Coulter | B21205 | clone B9.11 |
PG13 cells | ATCC | CRL-10686 | |
Phusion HF Buffer Pack | New England Biolabs | B0518S | |
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530L | |
pMX retroviral vector | Cell Biolabs | RTV-010 | |
polybrene | Sigma-Aldrich | H-9268 | |
Proleukin (recombinant human interleukin-2) | Novartis | by Rx only | equivalent product can be purchased from Sigma-Aldrich |
Purified anti-human CD3 antibody | Biolegend | 317301 | clone OKT3, used for T cell stimulation |
RPMI 1640 | Life Technologies | 11875119 | |
SA-PE | Life Technologies | S866 | used for multimerizing monomers from NIH tetramer core facility |
SMARTer RACE 5'/3' Kit | Clontech | 634858 | |
Sterile water | Wisent Bioproducts | 809-115-LL | |
SuperScript III First-Strand Synthesis System | Invitrogen | 18080051 | for cDNA synthesis |
Syringe | BD | 301604 | 10 mL, slip tip |
Tetracycline hydrochloride | Sigma-Aldrich | T7660 | |
TransIT-293 | Mirus Bio | MIR 2700 | used to transfect 293GPG cells |
TRIzol Reagent | Life Technologies | 15596026 |