توليد<em> دي نوفو</em> محددة مستضد تي الإنسان مستقبلات الخلية من قبل فيروسات تنبيغ من مركزية Hemichain
Summary
هنا نحن تصف طريقة رواية لتوليد مستقبلات الخلايا التائية مستضد معين (TCRs) من خلال إقران TCRα أو TCRβ من TCR القائمة، والتي تمتلك مستضد خصوصية الفائدة، مع hemichain مكملة للالمحيطي تي مستقبلات الخلية ذخيرة. دي نوفو TCRs لدت تحتفظ مستضد خصوصية مع اختلاف النسب.
Abstract
وتستخدم مستقبلات الخلايا التائية (TCRs) سريريا لتوجيه خصوصية خلايا T لاستهداف الأورام كطريقة واعدة من العلاج المناعي. ولذلك، استنساخ TCRs محددة لمختلف المستضدات المرتبطة الورم كان هدف العديد من الدراسات. للحصول على استجابة فعالة الخلايا التائية، يجب أن TCR التعرف على المستضد الهدف مع تقارب الأمثل. ومع ذلك، فقد تم استنساخ هذه TCRs تحديا والعديد من TCRs متاح تمتلك تقارب دون المستوى الأمثل للمستضد وما شابه ذلك. في هذا البروتوكول، ونحن تصف طريقة استنساخ دي نوفو عالية تقارب TCRs مستضد معين باستخدام TCRs القائمة من خلال استغلال hemichain المركزية التي. ومن المعروف أن لبعض TCRs، كل TCRα أو TCRβ hemichain لا تساهم بنفس القدر على الاعتراف مستضد، ويشار إلى hemichain المهيمنة على أنها hemichain مركزية. لقد أظهرنا أنه من خلال إقران hemichain مركزية مع مكافحة سلاسل مختلفة من الأصلي مكافحة السلسلة، ونحن قادرون على الحفاظ على مستضد الصورةpecificity، في حين تحوير قوة تفاعلها للمستضد وما شابه ذلك. وهكذا، فإن الإمكانات العلاجية لTCR معين يمكن أن تتحسن عن طريق تحسين الاقتران بين مركزية ومكافحة hemichains.
Introduction
مستقبلات الخلايا التائية (TCRs) هي heterodimeric مستقبلات المناعة التكيفية التي أعرب عنها الخلايا اللمفية تي، ويتألف من سلسلة TCRα وTCRβ. أنها ولدت عن طريق إعادة ترتيب الجسدية الخامس (D) J قطاعات الجينات التي تنتج ذخيرة متنوعة للغاية قادرة على الاعتراف تكوينات غير محدودة تقريبا من المجمعات HLA / الببتيد. سريريا، وقد أثبتت خلايا تي هندسيا للتعبير محددة TCRs clonotypic عن المستضدات المرتبطة ورم فعالية في مجموعة متنوعة من أنواع السرطان 1. ومع ذلك، فإن العديد من TCRs المستنسخة لهذا الغرض تفتقر تقارب كاف للمستضد من الفائدة، التي تحد من تطبيقها العلاجي.
هنا، نحن تصف طريقة للتغلب على هذا القيد لTCRs القائمة من خلال استغلال سلسلة المركزية التي. وقد أفيد أن واحدا TCR hemichain يمكن أن تلعب دورا أكثر هيمنة في الاعتراف المستضد الهدف 2، ووصف هنا المركزية التي. وقد أظهرت التحليلات الكريستال الهيكلية التي تركز على واحدhemichain من TCR يمكن أن تشكل الغالبية العظمى من البصمة على MHC / الببتيد معقد 3،4. باستخدام هذا المفهوم، لقد أثبتنا سابقا أن SIG35α TCRα يمكن الزوج مع ذخيرة متنوعة من السلاسل TCRβ والحفاظ على التفاعل ضد الببتيد MART1 27-35 قدمها HLA-A2 5. وتم الحصول على نتائج مماثلة مع TAK1 TCR، حيث TCRβ hemichain تتمحور يقترن سلاسل مختلفة TCRα والحفاظ على التفاعل لالببتيد WT1 235-243 قدمها HLA-A24 6. كلا MART1 وWT1 هي المستضدات المرتبطة الورم. تم تطبيق سلسلة المركزية التي أيضا لدراسة الاعتراف مستضد من TCRs ثابتة CD1d المقيدة القاتلة الطبيعية (iNKT)، عن طريق إقران ثابتة سلسلة Vα24-Jα18 (Vα24i) TCRα من TCRs iNKT الإنسان مع مختلف سلاسل Vβ11 TCRβ 7.
في جميع الحالات، وكنا قادرين على توليد دي نوفو مرجع TCRs التي كتبها العابرةducing وhemichain TCR مركزية لخلايا T الدم المحيطي، حيث hemichain قدم يقترن TCRα الذاتية أو TCRβ مكافحة السلاسل. في جوهرها، ويخدم hemichain تتمحور كطعم التي يمكن استخدامها لتحديد العداد سلاسل المناسبة، والتي عندما يقترن تشكل معا TCRs التي تحافظ على خصوصية المستضد من الفائدة، ولكن متفاوتة في النسب. من هذه ذخيرة جديدة، تمكنا من عزل TCRs clonotypic مع تحسين قوة تفاعل ضد مستضد الهدف مقارنة TCRs الموجودة مسبقا. ولذلك، فإننا نعتقد أن هذه طريقة تسريع خط أنابيب تحديد TCRs المثلى لتطبيق السريرية.
Protocol
Representative Results
Discussion
الشرط الأول لنجاح تطبيق هذه الطريقة هو تحقيق الكفاءة تنبيغ كافية من خلايا تي الأولية مع hemichain من الفائدة. في تجربتنا، والجمع بين استخدام PG13 كخط خلية التعبئة والتغليف وPMX كنتائج ناقلات فيروسات في التعبير مستقرة وفعالة من الجينات التي أدخلت في خلايا T الإنسان الأساسية. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH grant R01 CA148673 (NH); the Ontario Institute for Cancer Research Clinical Investigator Award IA-039 (NH); BioCanRX Catalyst Grant (NH); The Princess Margaret Cancer Foundation (MOB, NH); Canadian Institutes of Health Research Canada Graduate Scholarship (TG); Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Postgraduate Scholarship (TG); Province of Ontario (TG, MA); and Guglietti Fellowship Award (TO). HLA and CD1d monomers were kindly provided by the NIH tetramer core facility.
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA | Wisent Bioproducts | 325-043-CL | |
| 293GPG cells | Generated by Ory et al. (ref 8) | ||
| Agar | Wisent Bioproducts | 800-010-CG | |
| Agarose | Wisent Bioproducts | 800-015-CG | |
| Ampicillin sodium salt | Wisent Bioproducts | 400-110-IG | |
| Chloroform | BioShop | CCL402 | |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix | New England Biolabs | N0447L | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 11995065 | |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101S | |
| EZ-10 Spin Column DNA Gel Extraction Kit | BS353 | ||
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 12483020 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Filter | Corning | 431220 | 0.45 mm pore SFCA membrane |
| FITC-conjugated anti-human CD271 (NGFR) mAb | Biolegend | 345104 | clone ME20.4 |
| FITC-conjugated anti-human CD3 mAb | Biolegend | 300440 | clone UCHT1 |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750078 | |
| Gibson Assembly Master Mix | New England Biolabs | E2611L | used for multi-piece DNA assembly |
| HLA-A2 pentamer | Proimmune | depends on antigenic peptide | HLA-A2/MART1 multimer used here was purchased from Proimmune |
| HLA/CD1d monomers | NIH Tetramer Core Facility | multimerize monomers according to protocol provided by NIH tetramer core facility | |
| Human AB serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
| human CD3 microbeads | Miltenyi Biotec | 130-050-101 | |
| IOTest Beta Mark TCR V beta Repertoire Kit | Beckman Coulter | IM3497 | |
| Jurkat 76 cells | Generated by Heemskerk et al. (ref 10) | ||
| LB Broth | Wisent Bioproducts | 800-060-LG | |
| LS MACS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| NEB 5-alpha Competent E. coli | New England Biolabs | C2987I | |
| NEBuffer 3.1 | New England Biolabs | B7203S | used for EcoRI and NotI digestion |
| NotI | New England Biolabs | R0189S | |
| NucleoBond Xtra Midi | Macherey-Nagel | 740410 | used for plasmid purification |
| PC5-conjugated anti-human CD8 mAb | Beckman Coulter | B21205 | clone B9.11 |
| PG13 cells | ATCC | CRL-10686 | |
| Phusion HF Buffer Pack | New England Biolabs | B0518S | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530L | |
| pMX retroviral vector | Cell Biolabs | RTV-010 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | H-9268 | |
| Proleukin (recombinant human interleukin-2) | Novartis | by Rx only | equivalent product can be purchased from Sigma-Aldrich |
| Purified anti-human CD3 antibody | Biolegend | 317301 | clone OKT3, used for T cell stimulation |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 11875119 | |
| SA-PE | Life Technologies | S866 | used for multimerizing monomers from NIH tetramer core facility |
| SMARTer RACE 5'/3' Kit | Clontech | 634858 | |
| Sterile water | Wisent Bioproducts | 809-115-LL | |
| SuperScript III First-Strand Synthesis System | Invitrogen | 18080051 | for cDNA synthesis |
| Syringe | BD | 301604 | 10 mL, slip tip |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma-Aldrich | T7660 | |
| TransIT-293 | Mirus Bio | MIR 2700 | used to transfect 293GPG cells |
| TRIzol Reagent | Life Technologies | 15596026 |
References
- Maus, M. V., et al. Adoptive immunotherapy for cancer or viruses. Annu. Rev. Immunol. 32, 189-225 (2014).
- Yokosuka, T., , ., et al. Predominant role of T cell receptor (TCR)-alpha chain in forming preimmune TCR repertoire revealed by clonal TCR reconstitution system. J.Exp.Med. 195, 991-1001 (2002).
- Rudolph, M. G., Stanfield, R. L., Wilson, I. A. How TCRs bind MHCs, peptides, and coreceptors. Annu. Rev. Immunol. 24, 419-466 (2006).
- Shimizu, A., et al. Structure of TCR and antigen complexes at an immunodominant CTL epitope in HIV-1 infection. Sci. Rep. 3, 3097 (2013).
- Nakatsugawa, M., et al. Specific roles of each TCR hemichain in generating functional chain-centric TCR. J. Immunol. 194 (7), 3487-3500 (2015).
- Ochi, T., et al. Optimization of T-cell Reactivity by Exploiting TCR Chain Centricity for the Purpose of Safe and Effective Antitumor TCR Gene Therapy. Cancer Immunol. Res. 3 (9), 1070-1081 (2015).
- Chamoto, K., et al. CDR3beta sequence motifs regulate autoreactivity of human invariant NKT cell receptors. J. Autoimmun. 68, 39-51 (2016).
- Grozdanov, P. N., MacDonald, C. C. Generation of plasmid vectors expressing FLAG-tagged proteins under the regulation of human Elongation Factor-1α promoter using Gibson Assembly. J. Vis. Exp. (96), e52235 (2015).
- Beshiri, M. L., et al. Genome-wide analysis using ChIP to identify isoform-specific gene targets. J. Vis. Exp. (41), e2101 (2010).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat. Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Johnson, D., et al. Expression and structure of the human NGF receptor. Cell. 47 (4), 545-554 (1986).
- Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PloS one. 6, e18556 (2011).
- Yang, S., et al. Development of optimal bicistronic lentiviral vectors facilitates high-level TCR gene expression and robust tumor cell recognition. Gene Ther. 15 (21), 1411-1423 (2008).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J. Vis. Exp. (6), e253 (2007).
- Birnboim, H. C., Doly, J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 7 (6), 1513-1523 (1979).
- Ory, D. S., Neugeboren, B. A., Mulligan, R. C. A stable human-derived packaging cell line for production of high titer retrovirus/vesicular stomatitis virus G pseudotypes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93 (21), 11400-11406 (1996).
- Imataki, O., et al. IL-21 can supplement suboptimal Lck-independent MAPK activation in a STAT-3-dependent manner in human CD8(+) T cells. J. Immunol. 188 (4), 1609-1619 (2012).
- Davies, J. K., Barbon, C. M., Voskertchian, A. R., Nadler, L. M., Guinan, E. C. Induction of alloantigen-specific anergy in human peripheral blood mononuclear cells by alloantigen stimulation with co-stimulatory signal blockade. J. Vis. Exp. (49), e2673 (2011).
- Butcher, M. J., Herre, M., Ley, K., Galkina, E. Flow cytometry analysis of immune cells within murine aortas. J. Vis. Exp. (53), e2848 (2011).
- Butler, M. O., et al. Establishment of antitumor memory in humans using in vitro-educated CD8+ T cells. Sci. Transl. Med. 3 (80), 80ra34 (2011).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. 162 (1), 156-159 (1987).
- Peterson, S. M., Freeman, J. L. RNA isolation from embryonic zebrafish and cDNA synthesis for gene expression analysis. J. Vis. Exp. (30), e1470 (2009).
- Ying, S. Y., Ying, S. Y. Complementary DNA Libraries. Generation of cDNA Libraries: Methods and Protocols. 221, 1-12 (2003).
- Hirano, N., et al. Engagement of CD83 ligand induces prolonged expansion of CD8+ T cells and preferential enrichment for antigen specificity. Blood. 107 (4), 1528-1536 (2006).
- Scotto-Lavino, E., Du, G., Frohman, M. A. 5′ end cDNA amplification using classic RACE. Nat. Protoc. 1 (6), 2555-2562 (2006).
- Heemskerk, M. H., et al. Redirection of antileukemic reactivity of peripheral T lymphocytes using gene transfer of minor histocompatibility antigen HA-2-specific T-cell receptor complexes expressing a conserved alpha joining region. Blood. 102 (10), 3530-3540 (2003).
- Yan, H., et al. Magnetic cell sorting and flow cytometry sorting methods for the isolation and function analysis of mouse CD4+ CD25+ Treg cells. J. Zhejiang Univ. Sci. B. 10, 928-932 (2009).
- Padovan, E., et al. Expression of two T cell receptor alpha chains: dual receptor T cells. Science. 262 (5132), 422-424 (1993).
- Johnson, L. A., et al. transfer of tumor-reactive TCR confers both high avidity and tumor reactivity to nonreactive peripheral blood mononuclear cells and tumor-infiltrating lymphocytes. J. Immunol. 177 (9), 6548-6559 (2006).
- Chinnasamy, N., et al. A TCR targeting the HLA-A*0201-restricted epitope of MAGE-A3 recognizes multiple epitopes of the MAGE-A antigen superfamily in several types of cancer. J. Immunol. 186 (2), 685-696 (2011).
