порождающий<em> De Novo</em> Антиген-специфический человеческий Т-клеточный рецепторам трансдукции ретровирусных Centric Hemichain
Summary
Здесь мы опишем метод нового для генерации антиген-специфические Т-клеточные рецепторы (TCR) путем спаривания TCRα или TCR & beta существующего TCR, обладающих антигенной специфичности интересов, с дополнительным hemichain репертуара клеточных рецепторов периферических Т. В De Novo , сгенерированные ТКО сохраняют антиген-специфичность с различной аффинностью.
Abstract
Т-клеточные рецепторы (TCR), которые используются в клинике, чтобы направить специфичность Т-клеток целевых опухолей в качестве перспективного механизма иммунотерапии. Таким образом, клонирование ТКР специфические для различных ассоциированных с опухолью антигенов было целью многих исследований. Для того, чтобы вызвать эффективный Т-клеточный ответ, ТКС должен распознавать антиген-мишень с оптимальной сродства. Тем не менее, клонирование таких ТКО было проблемой, и многие доступны ТКО обладают субоптимальную сродством к родственным антигеном. В этом протоколе мы опишем метод клонирования De Novo высоким сродством антиген-специфические ТКО с использованием существующих ТКО за счет использования hemichain Centricity. Известно, что для некоторых ТКР, каждый TCRα или TCR & beta; hemichain не способствуют в равной степени к распознаванию антигена, и доминирующий hemichain упоминается как Центрическая hemichain. Мы показали, что путем спаривания Центрическая hemichain с ответными цепями, отличающимися от исходного контр-цепи, мы можем поддерживать антиген Specificity, в то время как модулировать свои силы взаимодействия для родственного антигена. Таким образом, терапевтический потенциал данного TCR может быть улучшена за счет оптимизации спаривание между центрированных и счетчик hemichains.
Introduction
Т-клеточные рецепторы (TCR) являются гетеродимерные адаптивные иммунные рецепторы, выраженные Т-лимфоциты, состоящие из цепи TCRα и TCR & beta;. Они генерируются с помощью соматической перегруппировки V (D) J сегментов гена, который производит чрезвычайно разнообразный репертуар, способных распознавать практически неограниченные конфигурации по HLA / пептидных комплексов. Клинически, Т – клетки , сконструированные для экспрессии клонотипическим ТКР , специфичные к опухолевым антигенам, продемонстрировали эффективность в различных раковых заболеваний 1. Тем не менее, многие ТКР клонированные для этой цели не обладают достаточной аффинностью к интересующему антигену, что ограничивает их терапевтическое применение.
Здесь мы опишем метод, чтобы преодолеть это ограничение для существующих ТКО за счет использования цепи Ориентированность. Сообщалось , что один TCR hemichain мог бы играть более доминирующую роль в признании антигена – мишени 2, здесь называют Centricity. Хрустальные структурные анализы показали, что один Centrichemichain из TCR может объяснить большинства след на MHC / пептид 3,4. Используя эту концепцию, ранее мы показали , что SIG35α TCRα может спариваться с разнообразным репертуаром TCR & beta ; цепей и поддерживать реактивность против MART1 27-35 пептида , представленного HLA-A2 5. Аналогичные результаты были получены с TAK1 TCR, где Центрическая TCR & beta ; hemichain сопряженным с различными цепями TCRα и обслуживаемой реакционной способностью по отношению к WT1 235-243 пептида , представленного HLA-A24 6. Оба MART1 и WT1, являются ассоциированные с опухолью антигены. Сеть Ориентированность был также применен для изучения распознавания антигена CD1d-ограниченных инвариантных натуральных киллеров (iNKT) ТКР, соединяя инвариантную Vα24-Jα18 (Vα24i) TCRα цепь ТКР iNKT человека с различными Vβ11 цепей TCR & beta ; 7.
Во всех случаях мы смогли сформировать заново репертуар ТКР по трансducing Центрическая TCR hemichain к Т-клеток периферической крови, где введена hemichain спаренных с эндогенным TCRα или TCR & beta; контр-цепей. По существу, ориентированный hemichain служит в качестве приманки, которые могут быть использованы для идентификации соответствующих встречные цепи, которые при сопряжении вместе образуют ТКО, которые поддерживают антигенную специфичность интерес, но различных по сродству. Из этих новых репертуаров, мы были в состоянии изолировать клонотипичной ТКО с улучшенной прочностью взаимодействия против антигена-мишени по сравнению с уже существующими ТКО. Поэтому мы считаем, этот метод ускорит трубопровод определения оптимальных ТКО для клинического применения.
Protocol
Representative Results
Discussion
Первое требование для успешного применения этого метода является достижение достаточной эффективности трансдукции первичных Т-клеток с hemichain интереса. По нашему опыту, сочетание использования PG13 в линии упаковки клеток и PMX в качестве ретровирусных вектора приводит к стабильной и эф?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH grant R01 CA148673 (NH); the Ontario Institute for Cancer Research Clinical Investigator Award IA-039 (NH); BioCanRX Catalyst Grant (NH); The Princess Margaret Cancer Foundation (MOB, NH); Canadian Institutes of Health Research Canada Graduate Scholarship (TG); Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Postgraduate Scholarship (TG); Province of Ontario (TG, MA); and Guglietti Fellowship Award (TO). HLA and CD1d monomers were kindly provided by the NIH tetramer core facility.
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA | Wisent Bioproducts | 325-043-CL | |
| 293GPG cells | Generated by Ory et al. (ref 8) | ||
| Agar | Wisent Bioproducts | 800-010-CG | |
| Agarose | Wisent Bioproducts | 800-015-CG | |
| Ampicillin sodium salt | Wisent Bioproducts | 400-110-IG | |
| Chloroform | BioShop | CCL402 | |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix | New England Biolabs | N0447L | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 11995065 | |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101S | |
| EZ-10 Spin Column DNA Gel Extraction Kit | BS353 | ||
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 12483020 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Filter | Corning | 431220 | 0.45 mm pore SFCA membrane |
| FITC-conjugated anti-human CD271 (NGFR) mAb | Biolegend | 345104 | clone ME20.4 |
| FITC-conjugated anti-human CD3 mAb | Biolegend | 300440 | clone UCHT1 |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750078 | |
| Gibson Assembly Master Mix | New England Biolabs | E2611L | used for multi-piece DNA assembly |
| HLA-A2 pentamer | Proimmune | depends on antigenic peptide | HLA-A2/MART1 multimer used here was purchased from Proimmune |
| HLA/CD1d monomers | NIH Tetramer Core Facility | multimerize monomers according to protocol provided by NIH tetramer core facility | |
| Human AB serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
| human CD3 microbeads | Miltenyi Biotec | 130-050-101 | |
| IOTest Beta Mark TCR V beta Repertoire Kit | Beckman Coulter | IM3497 | |
| Jurkat 76 cells | Generated by Heemskerk et al. (ref 10) | ||
| LB Broth | Wisent Bioproducts | 800-060-LG | |
| LS MACS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| NEB 5-alpha Competent E. coli | New England Biolabs | C2987I | |
| NEBuffer 3.1 | New England Biolabs | B7203S | used for EcoRI and NotI digestion |
| NotI | New England Biolabs | R0189S | |
| NucleoBond Xtra Midi | Macherey-Nagel | 740410 | used for plasmid purification |
| PC5-conjugated anti-human CD8 mAb | Beckman Coulter | B21205 | clone B9.11 |
| PG13 cells | ATCC | CRL-10686 | |
| Phusion HF Buffer Pack | New England Biolabs | B0518S | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530L | |
| pMX retroviral vector | Cell Biolabs | RTV-010 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | H-9268 | |
| Proleukin (recombinant human interleukin-2) | Novartis | by Rx only | equivalent product can be purchased from Sigma-Aldrich |
| Purified anti-human CD3 antibody | Biolegend | 317301 | clone OKT3, used for T cell stimulation |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 11875119 | |
| SA-PE | Life Technologies | S866 | used for multimerizing monomers from NIH tetramer core facility |
| SMARTer RACE 5'/3' Kit | Clontech | 634858 | |
| Sterile water | Wisent Bioproducts | 809-115-LL | |
| SuperScript III First-Strand Synthesis System | Invitrogen | 18080051 | for cDNA synthesis |
| Syringe | BD | 301604 | 10 mL, slip tip |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma-Aldrich | T7660 | |
| TransIT-293 | Mirus Bio | MIR 2700 | used to transfect 293GPG cells |
| TRIzol Reagent | Life Technologies | 15596026 |
References
- Maus, M. V., et al. Adoptive immunotherapy for cancer or viruses. Annu. Rev. Immunol. 32, 189-225 (2014).
- Yokosuka, T., , ., et al. Predominant role of T cell receptor (TCR)-alpha chain in forming preimmune TCR repertoire revealed by clonal TCR reconstitution system. J.Exp.Med. 195, 991-1001 (2002).
- Rudolph, M. G., Stanfield, R. L., Wilson, I. A. How TCRs bind MHCs, peptides, and coreceptors. Annu. Rev. Immunol. 24, 419-466 (2006).
- Shimizu, A., et al. Structure of TCR and antigen complexes at an immunodominant CTL epitope in HIV-1 infection. Sci. Rep. 3, 3097 (2013).
- Nakatsugawa, M., et al. Specific roles of each TCR hemichain in generating functional chain-centric TCR. J. Immunol. 194 (7), 3487-3500 (2015).
- Ochi, T., et al. Optimization of T-cell Reactivity by Exploiting TCR Chain Centricity for the Purpose of Safe and Effective Antitumor TCR Gene Therapy. Cancer Immunol. Res. 3 (9), 1070-1081 (2015).
- Chamoto, K., et al. CDR3beta sequence motifs regulate autoreactivity of human invariant NKT cell receptors. J. Autoimmun. 68, 39-51 (2016).
- Grozdanov, P. N., MacDonald, C. C. Generation of plasmid vectors expressing FLAG-tagged proteins under the regulation of human Elongation Factor-1α promoter using Gibson Assembly. J. Vis. Exp. (96), e52235 (2015).
- Beshiri, M. L., et al. Genome-wide analysis using ChIP to identify isoform-specific gene targets. J. Vis. Exp. (41), e2101 (2010).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat. Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Johnson, D., et al. Expression and structure of the human NGF receptor. Cell. 47 (4), 545-554 (1986).
- Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PloS one. 6, e18556 (2011).
- Yang, S., et al. Development of optimal bicistronic lentiviral vectors facilitates high-level TCR gene expression and robust tumor cell recognition. Gene Ther. 15 (21), 1411-1423 (2008).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J. Vis. Exp. (6), e253 (2007).
- Birnboim, H. C., Doly, J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 7 (6), 1513-1523 (1979).
- Ory, D. S., Neugeboren, B. A., Mulligan, R. C. A stable human-derived packaging cell line for production of high titer retrovirus/vesicular stomatitis virus G pseudotypes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93 (21), 11400-11406 (1996).
- Imataki, O., et al. IL-21 can supplement suboptimal Lck-independent MAPK activation in a STAT-3-dependent manner in human CD8(+) T cells. J. Immunol. 188 (4), 1609-1619 (2012).
- Davies, J. K., Barbon, C. M., Voskertchian, A. R., Nadler, L. M., Guinan, E. C. Induction of alloantigen-specific anergy in human peripheral blood mononuclear cells by alloantigen stimulation with co-stimulatory signal blockade. J. Vis. Exp. (49), e2673 (2011).
- Butcher, M. J., Herre, M., Ley, K., Galkina, E. Flow cytometry analysis of immune cells within murine aortas. J. Vis. Exp. (53), e2848 (2011).
- Butler, M. O., et al. Establishment of antitumor memory in humans using in vitro-educated CD8+ T cells. Sci. Transl. Med. 3 (80), 80ra34 (2011).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. 162 (1), 156-159 (1987).
- Peterson, S. M., Freeman, J. L. RNA isolation from embryonic zebrafish and cDNA synthesis for gene expression analysis. J. Vis. Exp. (30), e1470 (2009).
- Ying, S. Y., Ying, S. Y. Complementary DNA Libraries. Generation of cDNA Libraries: Methods and Protocols. 221, 1-12 (2003).
- Hirano, N., et al. Engagement of CD83 ligand induces prolonged expansion of CD8+ T cells and preferential enrichment for antigen specificity. Blood. 107 (4), 1528-1536 (2006).
- Scotto-Lavino, E., Du, G., Frohman, M. A. 5′ end cDNA amplification using classic RACE. Nat. Protoc. 1 (6), 2555-2562 (2006).
- Heemskerk, M. H., et al. Redirection of antileukemic reactivity of peripheral T lymphocytes using gene transfer of minor histocompatibility antigen HA-2-specific T-cell receptor complexes expressing a conserved alpha joining region. Blood. 102 (10), 3530-3540 (2003).
- Yan, H., et al. Magnetic cell sorting and flow cytometry sorting methods for the isolation and function analysis of mouse CD4+ CD25+ Treg cells. J. Zhejiang Univ. Sci. B. 10, 928-932 (2009).
- Padovan, E., et al. Expression of two T cell receptor alpha chains: dual receptor T cells. Science. 262 (5132), 422-424 (1993).
- Johnson, L. A., et al. transfer of tumor-reactive TCR confers both high avidity and tumor reactivity to nonreactive peripheral blood mononuclear cells and tumor-infiltrating lymphocytes. J. Immunol. 177 (9), 6548-6559 (2006).
- Chinnasamy, N., et al. A TCR targeting the HLA-A*0201-restricted epitope of MAGE-A3 recognizes multiple epitopes of the MAGE-A antigen superfamily in several types of cancer. J. Immunol. 186 (2), 685-696 (2011).
