Caracterização de complexos multi-subunidade de proteína de humano utilizando MxA não desnaturante em gel de poliacrilamida-electroforese

A estrutura quaternária de uma proteína desempenha um papel crucial em muitos processos celulares. Vias de sinalização, a expressão do gene e enzima de activação / desactivação todos contam com a montagem adequada de complexos de proteínas ^1-4. Este processo também conhecido como homo- ou hetero-oligomerização é devido à covalente irreversível ou interacções proteína-proteína electrostáticas e hidrofóbicas reversíveis. A oligomerização não só diversifica os diferentes processos celulares sem aumentar o tamanho do genoma, mas também fornece uma estratégia para construir proteínas de complexos estáveis que são mais resistentes à desnaturação e degradação no sentido ^5. Defeitos na oligomerização ter um impacto sobre a função de proteínas e pode levar ao desenvolvimento de doenças. Por exemplo, a enzima fenilalanina hidroxilase forma um complexo tetramérico. Algumas mutações dentro do complexo de proteína pode enfraquecer a formação tetrâmero e conduzir à doença fenilcetonúria ^6.

<p class = "jove_content"> A proteína MxA humano é um interferão (IFN) induzida por proteína efectora antiviral exercendo uma ampla actividade antiviral contra diversos ARN, bem como vírus de ADN ^7. Ela pertence à superfamília de grandes GTPases dinamina semelhante e tem a capacidade para formar grandes estruturas oligoméricas ⁸ in vitro. A oligomerização tem sido sugerido para proteger da degradação rápida MxA ^9,10. Apesar dos intensos esforços por vários grupos de pesquisa, o mecanismo molecular de ação permanece difícil e o papel do estado de oligomerização de MxA para a sua função antiviral está em debate ^9,11,12. A este respeito, Gao e colegas propuseram um modelo onde MxA exerce a sua actividade antiviral, interagindo com nucleoproteínas virais em forma de grandes estruturas oligoméricas em forma de anel ^11. No entanto, mais recentemente, demonstrou-se que os dímeros MXA exibem actividade antiviral e interagir com a nucleoproteína do vírus influenza A ^12. Bduziu sobre a estrutura de cristal de MxA, Gao e colaboradores identificaram vários resíduos de aminoácidos nas regiões de interface que são críticos para a sua oligomerização in vitro e a sua função antiviral ^11,13. Portanto, a fim de elucidar qual oligomérica estado de MxA exerce atividade antiviral, procurou-se estabelecer um protocolo simples para determinar rapidamente o estado oligmeric de mutantes de interface MXA expressos em células humanas, bem como endógena MxA expressa após a estimulação IFN.

Embora existam muitas técnicas que são comumente usados para investigar a interação entre proteínas, tais como a proteína split-Verde Fluorescente (split-GFP) ensaio de complementação ^14, ressonância de plasma de superfície ¹⁵ e Förster transferência de energia de ressonância (FRET) ^16, eles não fornecem informações da estequiometria exacta de um complexo de proteína oligomérica. Para a investigação deste aspecto particular, tal como técnicasmulti-ângulo de espalhamento de luz (MALS) ¹⁷ e ^{18 de} ultracentrifugação analítica são muito úteis. Geralmente, as proteínas analisadas usando estes métodos são proteínas purificadas. processos de oligomerização pode também depender de outros fatores celulares. Se estes factores são desconhecidas, a análise é mais difícil. Além disso, algumas proteínas são difíceis de expressar em E. coli e de purificar. Por conseguinte, estes métodos não são a escolha óptima para analisar a oligomerização de proteínas no meio celular. Além disso, essas técnicas exigem instrumentos dispendiosos que não estão facilmente disponíveis.

Não electroforese em gel desnaturante de poliacrilamida (PAGE), cromatografia de exclusão por tamanho ou por reticulação química convencional seguido de dodecil sulfato de sódio (SDS) -Página são ferramentas úteis para a caracterização da formação de oligómeros a partir de lisados de células ^2,19,20. Estes métodos não requerem equipamento especializado e podem ser facilmente PErformed num laboratório padrão. Nós inicialmente avaliados vários protocolos químicos de reticulação que invariavelmente levaram a agregação e precipitação de MxA não específica. Portanto, o próximo testados protocolos PRINCIPAL não desnaturante. Como não-PAGE desnaturante exclui a utilização de SDS, a migração das proteínas depende da sua carga nativa. PAGE nativa utiliza-Azul de Coomassie G250 azul brilhante para carregar proteínas com uma carga global negativa, semelhante a SDS, mas não desnaturar a proteína de ^21. Infelizmente, precipitados coomassie azul brilhante na presença de altas sais e catiões divalentes (por exemplo, Mg ²⁺⁾ que são muitas vezes incluídos em tampões de lise. Dependendo dos tampões utilizados, pode ser difícil de analisar a amostra sem mais passos de optimização que podem ter um efeito sobre o complexo de proteína oligomérica.

Aqui é apresentado um protocolo simples baseado num método anteriormente publicado em ²² para determinar de oligomerizaçãoproteína MxA humana derivada a partir de lisados ​​celulares usando não desnaturante PAGE.