Charakterisierung von Multi-Untereinheit Proteinkomplexe der Menschen MxA Verwendung von nicht-denaturierendes Polyacrylamidgel-Elektrophorese

Die quartäre Struktur eines Proteins spielt eine entscheidende Rolle in vielen zellulären Prozessen. Signalwege, Genexpression und Enzym Aktivierung / Deaktivierung alle verlassen sich auf die korrekte Montage von Proteinkomplexen ^1-4. Dieser Prozess auch als Homo- oder Hetero-Oligomerisierung bekannt, ist auf irreversible kovalente oder reversible elektrostatische und hydrophobe Protein-Protein-Wechselwirkungen. Oligomerisierung nicht nur diversifiziert die verschiedenen zellulären Prozessen , ohne die Genomgröße zunimmt, sondern bietet auch eine Strategie für Proteine stabile Komplexe zu bauen , die beständiger sind gegenüber Denaturierung und Abbau ^5. Defekte in Oligomerisierung wirken sich auf die Funktion von Proteinen und können zur Entwicklung von Krankheiten führen. Beispielsweise bildet das Enzym Phenylalaninhydroxylase eines tetrameren Komplexes. Einige Mutationen innerhalb des Proteinkomplexes können die Tetramerbildung schwächen und führen zu der Krankheit Phenylketonurie ^6.

<p class = "jove_content"> Die menschliche MxA Protein ein Interferon (IFN) -induzierten Protein antivirale Effektor ein breites antivirale Aktivität gegen verschiedene RNA als auch DNA – Viren ⁷ ausübt. Es gehört zur Superfamilie der dynamin artigen großen GTPasen und hat die Fähigkeit , in vitro ⁸ große oligomere Strukturen zu bilden. Die Oligomerisierung wurde vorgeschlagen , ^9,10 M · A vor einem schnellen Abbau zu schützen. Trotz intensiver Bemühungen von vielen Forschungsgruppen bleibt der molekulare Wirkmechanismus weitgehend ungeklärt und die Rolle des Oligomerisierungszustand von M · A für seine antivirale Funktion ist umstritten ^9,11,12. In dieser Hinsicht Gao und Mitarbeitern vorgeschlagen , ein Modell , in dem M · A durch die Interaktion mit viralen Nukleoproteine in Form von großen ringartigen oligomeren Strukturen ¹¹ seine antivirale Aktivität ausübt. Jedoch in jüngerer Zeit zeigten wir , dass MxA Dimere antivirale Aktivität aufweisen und mit dem Nukleoprotein von Influenza A Virus ¹² interagieren. Basierend auf der Kristallstruktur von M · A, Gao und Mitarbeitern identifiziert mehrere Aminosäurereste in den Grenzflächenbereichen , die ^11,13 für die Oligomerisierung in vitro und seine antivirale Funktion wichtig sind. Daher wird, um zu erläutern, welche oligomere Zustand MxA antivirale Aktivität ausübt, haben wir versucht, ein einfaches Protokoll zu schaffen, um schnell die oligmeric Zustand MxA Schnittstelle Mutanten in menschlichen Zellen als auch ausgedrückt bestimmen als endogene MxA nach IFN & alpha; Anregung ausgedrückt.

Obwohl es viele Techniken gibt, die die Wechselwirkung zwischen Proteinen zu untersuchen , wie die Split-Green Fluorescent Protein (split-GFP) Komplementations – Assay ^14, Oberflächenplasmonresonanz ¹⁵ und Förster – Resonanzenergietransfer (FRET) ¹⁶ häufig verwendet werden, bieten sie nicht Informationen über die genaue Stöchiometrie eines oligomeren Proteinkomplex. Zur Untersuchung dieser besonderen Aspekt Techniken wieMehrwinkellichtstreuung (MALS) ¹⁷ und analytische Ultrazentrifugation ¹⁸ sind sehr nützlich. Normalerweise analysiert die Proteine ​​mit Hilfe dieser Methoden sind gereinigte Proteine. Oligomerisierungsverfahren kann auch auf anderen zellulären Faktoren abhängen. Wenn diese Faktoren nicht bekannt sind, ist die Analyse schwieriger. Zusätzlich sind einige Proteine schwierig in E. auszudrücken coli und zu reinigen. Daher sind diese Verfahren nicht die optimale Wahl Protein Oligomerisierung in der zellulären Umgebung zu analysieren. Zusätzlich erfordern diese Techniken teure Instrumente, die nicht leicht verfügbar sind.

Nicht-denaturierende Polyacrylamid – Gelelektrophorese (PAGE), size exclusion chromatography oder chemische Vernetzung durch herkömmliche Natriumdodecylsulfat (SDS) -PAGE gefolgt sind nützliche Werkzeuge für die Charakterisierung der Bildung von Oligomeren aus Zelllysaten ^2,19,20. Diese Methoden erfordern keine spezielle Ausrüstung und kann leicht pe seinin einem Standard-Labor rformed. Wir haben uns zunächst verschiedene chemische Vernetzungsprotokolle ausgewertet, die invariant führte zu unspezifischen Aggregation und Ausfällung von M · A. Deshalb testeten wir als nächstes nicht denaturierende PAGE-Protokolle. Als nicht-denaturierende PAGE die Verwendung von SDS ausschließt, hängt die Migration von Proteinen auf ihre Mutter Ladung. Blau-native PAGE verwendet Coomassie Brilliant Blue G250 Proteine zu laden mit einer insgesamt negativen Ladung, ähnlich wie SDS, aber nicht denaturiert das Protein ^21. Leider Coomassie Brilliant Blue Präzipitate in Gegenwart hoher Salze und divalente Kationen (zB Mg ²⁺⁾ , die häufig in Lysepuffer enthalten sind. In Abhängigkeit von den verwendeten Puffer, kann es schwierig sein, die Probe ohne weitere Optimierung von Schritten zu analysieren, die eine Wirkung auf dem oligomeren Proteinkomplex haben.

Hier präsentieren wir ein einfaches Protokoll basiert auf einem zuvor veröffentlichten Verfahren ²² , um zu bestimmen OligomerisierungMensch MxA Protein aus Zellysaten abgeleitet unter Verwendung von nicht-denaturierende PAGE.