توصيف مجمعات متعدد فرعية البروتين من MXA الإنسان عن طريق عدم تغيير طبيعة بولي أكريلاميد هلام الكهربائي
Summary
This article describes a simple and rapid protocol to evaluate the oligomeric state of the dynamin-like GTPase MxA protein from lysates of human cells using a combination of non-denaturing PAGE with western blot analysis.
Abstract
The formation of oligomeric complexes is a crucial prerequisite for the proper structure and function of many proteins. The interferon-induced antiviral effector protein MxA exerts a broad antiviral activity against many viruses. MxA is a dynamin-like GTPase and has the capacity to form oligomeric structures of higher order. However, whether oligomerization of MxA is required for its antiviral activity is an issue of debate. We describe here a simple protocol to assess the oligomeric state of endogenously or ectopically expressed MxA in the cytoplasmic fraction of human cell lines by non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) in combination with Western blot analysis. A critical step of the protocol is the choice of detergents to prevent aggregation and/or precipitation of proteins particularly associated with cellular membranes such as MxA, without interfering with its enzymatic activity. Another crucial aspect of the protocol is the irreversible protection of the free thiol groups of cysteine residues by iodoacetamide to prevent artificial interactions of the protein. This protocol is suitable for a simple assessment of the oligomeric state of MxA and furthermore allows a direct correlation of the antiviral activity of MxA interface mutants with their respective oligomeric states.
Introduction
هيكل رباعي من بروتين يلعب دورا حاسما في العديد من العمليات الخلوية. مسارات الإشارات والتعبير الجيني، وانزيم تفعيل / تعطيل كل تعتمد على التجميع السليم للمجمعات البروتين 1-4. ومن المقرر أن التساهمية لا رجعة فيها أو عكسها تفاعلات البروتين البروتين كهرباء ومسعور هذه العملية التي تعرف أيضا باسم هومو أو مغاير oligomerization. Oligomerization ليس فقط ينوع العمليات الخلوية المختلفة دون زيادة حجم الجينوم، ولكنها توفر أيضا استراتيجية للبروتينات لبناء المجمعات المستقرة التي هي أكثر مقاومة تجاه تمسخ وتدهور 5. عيوب في oligomerization لها تأثير على وظيفة البروتينات ويمكن أن يؤدي إلى تطور أمراض. على سبيل المثال، هيدروكسيلاز أنزيم فينيل الأنين يشكل مجمع رباعي القسيمات. بعض الطفرات داخل المجمع البروتين يمكن أن تضعف تشكيل tetramer وتؤدي إلى بيلة الفينيل كيتون المرض 6.
<p clasالصورة = "jove_content"> البروتين MXA الإنسان هو مضاد للفيروسات (IFN) -induced المضادة للفيروسات البروتين المستجيب تمارس نشاط مضاد للفيروسات واسع ضد مختلف RNA، فضلا عن الفيروسات الحمض النووي 7. انه ينتمي الى الفصيلة من GTPases كبيرة مثل dynamin ولديه القدرة على تشكيل الهياكل بلازميدة قليلة القسيمات كبيرة في المختبر 8. وقد اقترح Oligomerization لحماية MXA من التدهور السريع 9،10. وعلى الرغم من الجهود المكثفة من قبل العديد من المجموعات البحثية، الآلية الجزيئية العمل لا تزال بعيدة المنال إلى حد كبير ودور الدولة oligomerization من MXA عن وظيفتها المضادة للفيروسات هو قيد المناقشة 9،11،12. وفي هذا الصدد، اقترح قاو وزملاء العمل نموذجا حيث يمارس MXA نشاطها المضاد للفيروسات من خلال التفاعل مع البروتينيات الفيروسية في شكل هياكل بلازميدة قليلة القسيمات كبيرة تشبه حلقة 11. ومع ذلك، في الآونة الأخيرة، أثبتنا أن dimers MXA المعرض نشاط مضاد للفيروسات وتتفاعل مع البروتين النووي من فيروس إنفلونزا 12. بASED على التركيب البلوري للMXA، حدد غاو وزملاء العمل عدة مخلفات الأحماض الأمينية في المناطق اجهة التي تعتبر بالغة الأهمية لoligomerization في المختبر وظيفة مضادة للفيروسات في 11،13. ولذلك، من أجل توضيح التي تنص على بلازميدة قليلة القسيمات من MXA تمارس نشاط مضاد للفيروسات، سعينا إلى وضع بروتوكول بسيط لتحديد بسرعة الدولة oligmeric من المسوخ واجهة MXA أعرب في الخلايا البشرية وكذلك أعرب الذاتية MXA بعد التحفيز IFNα.على الرغم من أن هناك العديد من التقنيات التي تستخدم عادة لتحقيق التفاعل بين البروتينات مثل بروتين تقسيم الفلوري الأخضر (تقسيم GFP) تكامل فحص 14، سطح مأكل بالرنين 15 و فورستر نقل الطاقة الرنين (الحنق) 16، فإنها لا توفر معلومات رياضيات الكيمياء الدقيق للمجمع البروتين بلازميدة قليلة القسيمات. للتحقيق في هذا الجانب بالذات، تقنيات مثلمتعددة زاوية تشتت الضوء (ملس) 17 وتنبيذ فائق التحليلية 18 هي مفيدة جدا. عادة، والبروتينات تحليلها باستخدام هذه الأساليب هي بروتينات النقاء. قد تعتمد عمليات Oligomerization أيضا على عوامل الخلوية الأخرى. وإذا كانت هذه العوامل هي غير معروفة، وتحليل أكثر صعوبة. بالإضافة إلى ذلك، بعض البروتينات يصعب التعبير عنها في E. القولونية وتنقية. لذلك، وهذه الأساليب ليست هي الخيار الأمثل لتحليل oligomerization البروتين في البيئة الخلوية. وبالإضافة إلى ذلك، هذه التقنيات تتطلب الأدوات الباهظة الثمن التي لا تتوفر بسهولة.
غير تغيير طبيعة الكهربائي للهلام بولي أكريلاميد (PAGE)، اللوني حجم الإقصاء أو يشابك الكيميائية تليها التقليدية دوديسيل الصوديوم كبريتات (SDS) -PAGE هي أدوات مفيدة لتوصيف تشكيل الأوليغومرات من الخلية لست] 2،19،20. هذه الأساليب لا تتطلب معدات متخصصة ويمكن أن يكون المؤسسة العامة بسهولةrformed في المختبر القياسية. قمنا بتقييم البداية مختلف البروتوكولات عبر ربط الكيميائية التي أدت invariantly إلى تجميع وترسيب MXA غير محددة. لذلك، نحن اختبار القادم بروتوكولات PAGE عدم تغيير طبيعة. كما تستثني عدم تغيير طبيعة-PAGE استخدام SDS، والهجرة من البروتينات يعتمد على تهمة وطنهم. يستخدم زرقاء أصلية PAGE coomassie G250 الزرقاء الرائعة لتحميل البروتينات مع شحنة سالبة العام، على غرار SDS، ولكن لا تفسد البروتين 21. للأسف، coomassie رواسب الزرقاء الرائعة في وجود الأملاح العالية والكاتيونات ثنائي التكافؤ (مثل المغنيسيوم 2+) التي غالبا ما يتم تضمينها في مخازن تحلل. اعتمادا على مخازن المستخدمة، قد يكون من الصعب لتحليل عينة من دون مزيد من التحسين من الخطوات التي يمكن أن يكون لها تأثير على بروتين معقد بلازميدة قليلة القسيمات.
هنا نقدم بروتوكول البسيط القائم على طريقة نشرت سابقا 22 لتحديد oligomerization منالبروتين MXA حقوق الإنسان مستمد من لست] الخلوية استخدام غير تغيير طبيعة-PAGE.
Protocol
Representative Results
Discussion
نحن هنا وصف طريقة بسيطة التي تسمح بتحديد السريع للدولة بلازميدة قليلة القسيمات من البروتينات التي أعرب عنها في خلايا الثدييات التي PAGE عدم تغيير طبيعة-يليه تحليل لطخة غربية. والميزة الرئيسية لهذا النهج هو أن الدولة بلازميدة قليلة القسيمات من بروتين معين يمكن تحديده ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by a Grant from the Swiss National Science foundation (Grant nr. 31003A_143834) to JP.
Materials
| Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Units, 10K MWCO, 0.5 mL | Thermo Fisher Scientific | 69570 | Pre-equilibrate in dialysis buffer ( if Glycerol removal is desired) Can be self-made according to Fiala et al. 2011 |
| 4–15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, | Bio-Rad | 456-1083 | Pre-run in running buffer to adjust buffer system |
| cOmplete, Mini, EDTA-free | Roche | 11836170001 | use 1 tablet per 50 ml |
| PBS, pH 7.4 bottle a 500ml Gibco | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| Ponceau S solution | Sigma-Aldrich | P7170 | toxic! wear gloves and protect eyes! |
| NativeMark Unstained Protein Standard 50ul | Invitrogen | P/N 57030 | load 5 ul/well |
| A549 cells | ATCC | ATCC CCL185 | Grow in growth medium (see Table 1) |
| Vero cells | ATCC | ATCC CCL81 | Grow in growth medium (see Table 1) |
| anti-Mx1 antibody | Novus Biologicals | H00004599_D01P | Use at a 1:1000 dilution |
| ECL Anti-rabbit IgG, Horseradish Peroxidase linked whole antibody (from donkey) | GE-Healthcare | NA934V | Use at a 1:10000 dilution |
| 0.5% Trypsin-EDTA (1x) Life Technologies | Thermo Fisher | 15400-054 | |
| Iodoacetamide 5g | Sigma-Aldrich | I-6125 | stock 100mM |
| Bromphenolblue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| DMEM +4.5g/l Gluc,+L-Glut,+Pyruvate life technologies | Thermo Fisher Scientific | 41966-029 | |
| Pen Strep 100 x 100ml life technologies | Thermo Fisher Scientific | 15140 – 130 | |
| Glutamax 100xStock, 100ml life technologies | Thermo Fisher Scientific | 350500-038 | |
| Fetal Bovine Serum, Dialyzed , US Origin 500ml Gibco Lot:42G9552K | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| Cellulose filter paper | Bio-Rad | 1703965 | |
| PVDV blotting membrane | GE-Healthcare | 10600022 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Biosolve | 0020092391BS | |
| sodium fluoride (NaF) | Sigma Aldrich | S-7920 | |
| NP-40 | Calbiochem | 492015 | |
| cOmplete, Mini, EDTA-free | Roche | 11836170001 | |
| Tween 20 | Calbiochem | 6555204 | |
| CHAPS 10% solution | Amresco | N907 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | 43819 | |
| Glycine | Biosolve | 0007132391BS | |
| sodium orthovanadate (Na3VO4) | Sigma Aldrich | 450243 | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G7757 | |
| b-Glycerophospate | Sigma Aldrich | G9422 | |
| Milk powder | Migros/Switzerland | ||
| Methanol | Millipore | 1.06009 | |
| sodium cloride (NaCl) | Sigma Aldrich | 71380 | |
| magnesium chloride (MgCl2) | Amresco | 288 | |
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Sigma Aldrich | L4509 | |
| sodium hydroxide (NaOH) | Sigma Aldrich | S-8045 |
References
- Baisamy, L., Jurisch, N., Diviani, D. Leucine zipper-mediated homo-oligomerization regulates the Rho-GEF activity of AKAP-Lbc. J Biol Chem. 280, 15405-15412 (2005).
- Chen, C. P., Posy, S., Ben-Shaul, A., Shapiro, L., Honig, B. H. Specificity of cell-cell adhesion by classical cadherins: Critical role for low-affinity dimerization through beta-strand swapping. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 8531-8536 (2005).
- Jackson-Fisher, A. J., Chitikila, C., Mitra, M., Pugh, B. F. A role for TBP dimerization in preventing unregulated gene expression. Mol Cell. 3, 717-727 (1999).
- Torshin, I. Activating oligomerization as intermediate level of signal transduction: analysis of protein-protein contacts and active sites in several glycolytic enzymes. Front Biosci. 4, 557-570 (1999).
- Goodsell, D. S., Olson, A. J. Structural symmetry and protein function. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 29, 105-153 (2000).
- Flydal, M. I., Martinez, A. Phenylalanine hydroxylase: function, structure, and regulation. IUBMB Life. 65, 341-349 (2013).
- Haller, O., Kochs, G. Human MxA protein: an interferon-induced dynamin-like GTPase with broad antiviral activity. J Interferon Cytokine Res. 31, 79-87 (2011).
- Haller, O., Staeheli, P., Schwemmle, M., Kochs, G. Mx GTPases: dynamin-like antiviral machines of innate immunity. Trends Microbiol. 23, 154-163 (2015).
- Di Paolo, C., Hefti, H. P., Meli, M., Landis, H., Pavlovic, J. Intramolecular backfolding of the carboxyl-terminal end of MxA protein is a prerequisite for its oligomerization. J Biol Chem. 274, 32071-32078 (1999).
- Janzen, C., Kochs, G., Haller, O. A monomeric GTPase-negative MxA mutant with antiviral activity. J Virol. 74, 8202-8206 (2000).
- Gao, S., et al. Structure of myxovirus resistance protein a reveals intra- and intermolecular domain interactions required for the antiviral function. Immunity. 35, 514-525 (2011).
- Nigg, P. E., Pavlovic, J. Oligomerization and GTP-binding Requirements of MxA for Viral Target Recognition and Antiviral Activity against Influenza A Virus. J Biol Chem. 290, 29893-29906 (2015).
- Gao, S., et al. Structural basis of oligomerization in the stalk region of dynamin-like MxA. Nature. 465, 502-506 (2010).
- Ghosh, I., Hamilton, A. D., Regan, L. Antiparallel leucine zipper-directed protein reassembly: Application to the green fluorescent protein. J Am Chem Soc. 122, 5658-5659 (2000).
- Patching, S. G. Surface plasmon resonance spectroscopy for characterisation of membrane protein-ligand interactions and its potential for drug discovery. Biochim Biophys Acta. 1838, 43-55 (2014).
- Kenworthy, A. K. Imaging protein-protein interactions using fluorescence resonance energy transfer microscopy. Methods. 24, 289-296 (2001).
- Wyatt, P. J. Light-Scattering and the Absolute Characterization of Macromolecules. Analytica Chimica Acta. 272 (93), 1-40 (1993).
- Howlett, G. J., Minton, A. P., Rivas, G. Analytical ultracentrifugation for the study of protein association and assembly. Curr Opin Chem Biol. 10, 430-436 (2006).
- Fiala, G. J., Schamel, W. W., Blumenthal, B. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates. J Vis Exp. , (2011).
- Zou, H., Li, Y., Liu, X., Wang, X. An APAF-1.cytochrome c multimeric complex is a functional apoptosome that activates procaspase-9. J Biol Chem. 274, 11549-11556 (1999).
- Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis. Anal Biochem. 217, 220-230 (1994).
- Walker, J. M. Nondenaturing polyacrylamide gel electrophoresis of proteins. Methods Mol Biol. 32, 17-22 (1994).
- Stoscheck, C. M. Quantitation of protein. Methods Enzymol. 182, 50-68 (1990).
- Wisskirchen, C., Ludersdorfer, T. H., Muller, D. A., Moritz, E., Pavlovic, J. Interferon-induced antiviral protein MxA interacts with the cellular RNA helicases UAP56 and URH49. J Biol Chem. 286, 34743-34751 (2011).
- Stertz, S., et al. Interferon-induced, antiviral human MxA protein localizes to a distinct subcompartment of the smooth endoplasmic reticulum. J Interferon Cytokine Res. 26, 650-660 (2006).
- Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochim Biophys Acta. 1666, 105-117 (2004).
- Kochs, G., Haener, M., Aebi, U., Haller, O. Self-assembly of human MxA GTPase into highly ordered dynamin-like oligomers. J Biol Chem. 277, 14172-14176 (2002).
- Kochs, G., Haller, O. GTP-bound human MxA protein interacts with the nucleocapsids of Thogoto virus (Orthomyxoviridae). J Biol Chem. 274, 4370-4376 (1999).
- Reichelt, M., Stertz, S., Krijnse-Locker, J., Haller, O., Kochs, G. Missorting of LaCrosse virus nucleocapsid protein by the interferon-induced MxA GTPase involves smooth ER membranes. Traffic. 5, 772-784 (2004).
- Wisskirchen, C., Ludersdorfer, T. H., Muller, D. A., Moritz, E., Pavlovic, J. The cellular RNA helicase UAP56 is required for prevention of double-stranded RNA formation during influenza A virus infection. J Virol. 85, 8646-8655 (2011).
