Denatüre edici olmayan poliakrilamid jel elektroforez kullanılarak insan mxa Çok alt birim protein kompleksleri karakterizasyonu
Summary
This article describes a simple and rapid protocol to evaluate the oligomeric state of the dynamin-like GTPase MxA protein from lysates of human cells using a combination of non-denaturing PAGE with western blot analysis.
Abstract
The formation of oligomeric complexes is a crucial prerequisite for the proper structure and function of many proteins. The interferon-induced antiviral effector protein MxA exerts a broad antiviral activity against many viruses. MxA is a dynamin-like GTPase and has the capacity to form oligomeric structures of higher order. However, whether oligomerization of MxA is required for its antiviral activity is an issue of debate. We describe here a simple protocol to assess the oligomeric state of endogenously or ectopically expressed MxA in the cytoplasmic fraction of human cell lines by non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) in combination with Western blot analysis. A critical step of the protocol is the choice of detergents to prevent aggregation and/or precipitation of proteins particularly associated with cellular membranes such as MxA, without interfering with its enzymatic activity. Another crucial aspect of the protocol is the irreversible protection of the free thiol groups of cysteine residues by iodoacetamide to prevent artificial interactions of the protein. This protocol is suitable for a simple assessment of the oligomeric state of MxA and furthermore allows a direct correlation of the antiviral activity of MxA interface mutants with their respective oligomeric states.
Introduction
Bir proteinin kuaterner yapı, birçok hücresel süreçlerde önemli bir rol oynar. Sinyal yolları, gen ifadesi ve enzim devreye alma / devreden tüm protein kompleksleri 1-4 doğru montaj güveniyor. Ayrıca, homo veya hetero-oligomerizasyonu olarak da bilinen bu proses geri dönüşü olmayan kovalent ya da geri dönüşümlü, elektrostatik ve hidrofobik protein-protein etkileşimleri kaynaklanmaktadır. Oligomerizasyon genom boyutunu artırmadan farklı hücresel süreçleri çeşitlendirmektedir, ancak proteinler denatürasyon ve yıkımı 5 karşı daha dirençli kararlı kompleksler inşa etmek için de bir strateji sağlar sadece. oligomerizasyonu bozukluklar protein fonksiyonu üzerinde bir etkisi vardır ve hastalığın gelişmesine yol açar. Örneğin, enzim, fenilalanin hidroksilaz tetrameric kompleks oluşturur. Protein kompleksi içindeki bazı mutasyonlar tetramer oluşumu zayıflatmak ve hastalık fenilketonüri 6 yol açabilir.
<p class = "jove_content"> insan MxA proteini anti-viral, çeşitli RNA karşı geniş bir anti-viral aktivitesi uygulayıcı efektör protein hem de DNA virüslerini 7 indüklenen bir interferon (IFN) 'dir. Bu Dynamin-gibi büyük GTPases üst ailesine ait olan ve in vitro 8 büyük oligomerik yapıları oluşturma kapasitesine sahiptir. Oligomerizasyonu, hızlı bozulmaya 9,10 arasında mxa korumak için önerilmiştir. Birçok araştırma grubu tarafından yoğun çabalarına rağmen, eylem moleküler mekanizması büyük ölçüde belirsiz kalır ve antiviral işlevi için mxa oligomerizasyon devletin rolü tartışma 9,11,12 altındadır. Bu bağlamda, Gao ve ark MxA büyük halka benzeri oligomerik yapılarının 11 şeklinde viral Nükleoproteinlerin ile etkileşerek antiviral aktivite sergiler bir model önerdi. Ancak, son zamanlarda biz MxA dimerleri antivirütik aktivite sergilerler ve grip A virüsü 12 nükleoprotein ile etkileşim olduğu gösterilmiştir. Bmxa kristal yapısına ased Gao ve çalışma arkadaşları, in vitro olarak oligomerizasyonu ve antiviral fonksiyonu 11,13 için kritik olan arayüz bölgelerde çeşitli amino asit kalıntıları tespit edilmiştir. Bu nedenle, anti-viral aktivite sergiler mxa oligomerik çizen aydınlatmak üzere, hızla endojen MxA IFNa uyarıldıktan sonra ifade hem de insan hücrelerinde ifade edilen bir MxA arayüz mutantlarının oligmeric durumunu belirlemek için basit bir protokol için çalışmıştır.Gibi yaygın bölünmüş Yeşil Floresan Protein olarak proteinler arasındaki etkileşimi araştırmak için kullanılan birçok teknik olmasına rağmen (split-GFP) tamamlama deneyi 14, yüzey plazmon rezonans 15 ve Förster rezonans enerji transferi (FRET) 16, onlar vermeyin bir oligomerik bir protein kompleksinin tam stokiyometri bilgiler. bu özel yanının araştırılması için teknikler gibiçok açılı bir ışık saçılım (MALS) 17 ve analitik ultrasantrifügasyon 18 çok kullanışlıdır. Genellikle, bu yöntemler kullanılarak analiz proteinler saflaştırılmış proteinlerdir. Oligomerleştirme işlemleriyle, diğer hücresel faktörlere bağlı olabilir. Bu faktörler bilinmiyorsa, analiz çok daha zordur. Ayrıca, bazı proteinler E. ifade etmek zordur E. coli ve saflaştırılması için. Bu nedenle, bu yöntemler hücresel ortamda protein oligomerizasyon analiz için en uygun seçenek değildir. Buna ek olarak, bu teknikler hazır olmayan pahalı aletleri gerektirir.
Denatüre edici olmayan poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE), boyut dışlama kromatografisi ya da geleneksel sodyum dodesil sülfat (SDS) sayfalık, ardından kimyasal çapraz bağlama hücre lizatları 2,19,20 gelen oligomerlerin oluşma özellikleri için yararlı araçlardır. Bu yöntemler özel ekipman gerektirmez ve kolayca pe olabilirStandart bir laboratuarda rformed. Başlangıçta değişmez spesifik olmayan birleşimine ve mxa çökelmesine yol çeşitli kimyasal çapraz bağlama protokolleri değerlendirildi. Bu nedenle, önümüzdeki olmayan denatüre SAYFA protokolleri test etti. olmayan denatüre SAYFA SDS kullanımını hariç olarak, proteinlerin göç kendi ana şarj bağlıdır. Mavi yerel PAGE SDS benzer bir negatif yük, proteinleri yüklemek için Coomassie parlak mavisi G250 kullanır, ancak protein 21 denatüre etmez. Ne yazık ki, yüksek tuzlar ve genellikle lizis tampon içerdiği iki değerlikli katyonlar (örneğin, Mg + 2) varlığında, parlak mavi çökeltileri coomassie. kullanılan tamponlar bağlı olarak, oligomerik protein kompleksi üzerinde bir etkiye sahip olabilir adımların daha fazla optimizasyon yapmadan numuneyi analiz etmek zor olabilir.
Burada oligomerizasyonuna belirlemek için, daha önce yayınlanan bir yöntem 22 dayalı basit bir protokol mevcutdenatüre PAGE kullanılarak hücre lizatları elde edilen insan MxA proteini.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada Western blot analizi ile, ardından denatüre PAGE ile memeli hücrelerinde ifade edilen proteinlerin oligomerik durum hızla belirlenmesini sağlayan basit bir yöntem tarif eder. Bu yaklaşımın en önemli avantajı, belirli bir proteinin oligomerik durumu önceden protein saflaştırma olmadan bütün hücre lizatları belirlenebilir olmasıdır. Bu oligomerize veya yardımcı faktörler ile birlikte kendi işlevini yerine proteinler için önemli olabilir. Buna ek olarak, proteinler, yerli durumunda hala ve …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by a Grant from the Swiss National Science foundation (Grant nr. 31003A_143834) to JP.
Materials
| Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Units, 10K MWCO, 0.5 mL | Thermo Fisher Scientific | 69570 | Pre-equilibrate in dialysis buffer ( if Glycerol removal is desired) Can be self-made according to Fiala et al. 2011 |
| 4–15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, | Bio-Rad | 456-1083 | Pre-run in running buffer to adjust buffer system |
| cOmplete, Mini, EDTA-free | Roche | 11836170001 | use 1 tablet per 50 ml |
| PBS, pH 7.4 bottle a 500ml Gibco | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| Ponceau S solution | Sigma-Aldrich | P7170 | toxic! wear gloves and protect eyes! |
| NativeMark Unstained Protein Standard 50ul | Invitrogen | P/N 57030 | load 5 ul/well |
| A549 cells | ATCC | ATCC CCL185 | Grow in growth medium (see Table 1) |
| Vero cells | ATCC | ATCC CCL81 | Grow in growth medium (see Table 1) |
| anti-Mx1 antibody | Novus Biologicals | H00004599_D01P | Use at a 1:1000 dilution |
| ECL Anti-rabbit IgG, Horseradish Peroxidase linked whole antibody (from donkey) | GE-Healthcare | NA934V | Use at a 1:10000 dilution |
| 0.5% Trypsin-EDTA (1x) Life Technologies | Thermo Fisher | 15400-054 | |
| Iodoacetamide 5g | Sigma-Aldrich | I-6125 | stock 100mM |
| Bromphenolblue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| DMEM +4.5g/l Gluc,+L-Glut,+Pyruvate life technologies | Thermo Fisher Scientific | 41966-029 | |
| Pen Strep 100 x 100ml life technologies | Thermo Fisher Scientific | 15140 – 130 | |
| Glutamax 100xStock, 100ml life technologies | Thermo Fisher Scientific | 350500-038 | |
| Fetal Bovine Serum, Dialyzed , US Origin 500ml Gibco Lot:42G9552K | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| Cellulose filter paper | Bio-Rad | 1703965 | |
| PVDV blotting membrane | GE-Healthcare | 10600022 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Biosolve | 0020092391BS | |
| sodium fluoride (NaF) | Sigma Aldrich | S-7920 | |
| NP-40 | Calbiochem | 492015 | |
| cOmplete, Mini, EDTA-free | Roche | 11836170001 | |
| Tween 20 | Calbiochem | 6555204 | |
| CHAPS 10% solution | Amresco | N907 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | 43819 | |
| Glycine | Biosolve | 0007132391BS | |
| sodium orthovanadate (Na3VO4) | Sigma Aldrich | 450243 | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G7757 | |
| b-Glycerophospate | Sigma Aldrich | G9422 | |
| Milk powder | Migros/Switzerland | ||
| Methanol | Millipore | 1.06009 | |
| sodium cloride (NaCl) | Sigma Aldrich | 71380 | |
| magnesium chloride (MgCl2) | Amresco | 288 | |
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Sigma Aldrich | L4509 | |
| sodium hydroxide (NaOH) | Sigma Aldrich | S-8045 |
References
- Baisamy, L., Jurisch, N., Diviani, D. Leucine zipper-mediated homo-oligomerization regulates the Rho-GEF activity of AKAP-Lbc. J Biol Chem. 280, 15405-15412 (2005).
- Chen, C. P., Posy, S., Ben-Shaul, A., Shapiro, L., Honig, B. H. Specificity of cell-cell adhesion by classical cadherins: Critical role for low-affinity dimerization through beta-strand swapping. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 8531-8536 (2005).
- Jackson-Fisher, A. J., Chitikila, C., Mitra, M., Pugh, B. F. A role for TBP dimerization in preventing unregulated gene expression. Mol Cell. 3, 717-727 (1999).
- Torshin, I. Activating oligomerization as intermediate level of signal transduction: analysis of protein-protein contacts and active sites in several glycolytic enzymes. Front Biosci. 4, 557-570 (1999).
- Goodsell, D. S., Olson, A. J. Structural symmetry and protein function. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 29, 105-153 (2000).
- Flydal, M. I., Martinez, A. Phenylalanine hydroxylase: function, structure, and regulation. IUBMB Life. 65, 341-349 (2013).
- Haller, O., Kochs, G. Human MxA protein: an interferon-induced dynamin-like GTPase with broad antiviral activity. J Interferon Cytokine Res. 31, 79-87 (2011).
- Haller, O., Staeheli, P., Schwemmle, M., Kochs, G. Mx GTPases: dynamin-like antiviral machines of innate immunity. Trends Microbiol. 23, 154-163 (2015).
- Di Paolo, C., Hefti, H. P., Meli, M., Landis, H., Pavlovic, J. Intramolecular backfolding of the carboxyl-terminal end of MxA protein is a prerequisite for its oligomerization. J Biol Chem. 274, 32071-32078 (1999).
- Janzen, C., Kochs, G., Haller, O. A monomeric GTPase-negative MxA mutant with antiviral activity. J Virol. 74, 8202-8206 (2000).
- Gao, S., et al. Structure of myxovirus resistance protein a reveals intra- and intermolecular domain interactions required for the antiviral function. Immunity. 35, 514-525 (2011).
- Nigg, P. E., Pavlovic, J. Oligomerization and GTP-binding Requirements of MxA for Viral Target Recognition and Antiviral Activity against Influenza A Virus. J Biol Chem. 290, 29893-29906 (2015).
- Gao, S., et al. Structural basis of oligomerization in the stalk region of dynamin-like MxA. Nature. 465, 502-506 (2010).
- Ghosh, I., Hamilton, A. D., Regan, L. Antiparallel leucine zipper-directed protein reassembly: Application to the green fluorescent protein. J Am Chem Soc. 122, 5658-5659 (2000).
- Patching, S. G. Surface plasmon resonance spectroscopy for characterisation of membrane protein-ligand interactions and its potential for drug discovery. Biochim Biophys Acta. 1838, 43-55 (2014).
- Kenworthy, A. K. Imaging protein-protein interactions using fluorescence resonance energy transfer microscopy. Methods. 24, 289-296 (2001).
- Wyatt, P. J. Light-Scattering and the Absolute Characterization of Macromolecules. Analytica Chimica Acta. 272 (93), 1-40 (1993).
- Howlett, G. J., Minton, A. P., Rivas, G. Analytical ultracentrifugation for the study of protein association and assembly. Curr Opin Chem Biol. 10, 430-436 (2006).
- Fiala, G. J., Schamel, W. W., Blumenthal, B. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates. J Vis Exp. , (2011).
- Zou, H., Li, Y., Liu, X., Wang, X. An APAF-1.cytochrome c multimeric complex is a functional apoptosome that activates procaspase-9. J Biol Chem. 274, 11549-11556 (1999).
- Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis. Anal Biochem. 217, 220-230 (1994).
- Walker, J. M. Nondenaturing polyacrylamide gel electrophoresis of proteins. Methods Mol Biol. 32, 17-22 (1994).
- Stoscheck, C. M. Quantitation of protein. Methods Enzymol. 182, 50-68 (1990).
- Wisskirchen, C., Ludersdorfer, T. H., Muller, D. A., Moritz, E., Pavlovic, J. Interferon-induced antiviral protein MxA interacts with the cellular RNA helicases UAP56 and URH49. J Biol Chem. 286, 34743-34751 (2011).
- Stertz, S., et al. Interferon-induced, antiviral human MxA protein localizes to a distinct subcompartment of the smooth endoplasmic reticulum. J Interferon Cytokine Res. 26, 650-660 (2006).
- Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochim Biophys Acta. 1666, 105-117 (2004).
- Kochs, G., Haener, M., Aebi, U., Haller, O. Self-assembly of human MxA GTPase into highly ordered dynamin-like oligomers. J Biol Chem. 277, 14172-14176 (2002).
- Kochs, G., Haller, O. GTP-bound human MxA protein interacts with the nucleocapsids of Thogoto virus (Orthomyxoviridae). J Biol Chem. 274, 4370-4376 (1999).
- Reichelt, M., Stertz, S., Krijnse-Locker, J., Haller, O., Kochs, G. Missorting of LaCrosse virus nucleocapsid protein by the interferon-induced MxA GTPase involves smooth ER membranes. Traffic. 5, 772-784 (2004).
- Wisskirchen, C., Ludersdorfer, T. H., Muller, D. A., Moritz, E., Pavlovic, J. The cellular RNA helicase UAP56 is required for prevention of double-stranded RNA formation during influenza A virus infection. J Virol. 85, 8646-8655 (2011).
