Ensayos para estudiar el rol de vitronectina en la adhesión bacteriana y resistencia de suero
Summary
Este informe describe los protocolos para la caracterización de las interacciones entre proteínas de membrana externa bacteriana y la vitronectina de regulador del complemento humano. Los protocolos pueden utilizarse para estudiar las reacciones de enlace y función biológica de vitronectina en cualquier especie bacteriana.
Abstract
Las bacterias utilizan reguladores del complemento como un medio de evadir la respuesta inmune del huésped. Aquí, describimos protocolos para la evaluación de la adquisición de vitronectina de papel en los juegos de célula bacteriana superficial en la resistencia al sistema inmune anfitrión. Experimentos de citometría de flujo identifican vitronectina de plasma humano como un ligando de la proteína de membrana externa bacteriana del receptor H de Haemophilus influenzae tipo f. Un análisis enzima-ligado del inmunosorbente era empleado para caracterizar las interacciones proteína-proteína entre proteínas recombinantes purificadas H y vitronectina y atar afinidad se evaluó mediante interferometría de la bio-capa. La importancia biológica de la Unión de la vitronectina a H la proteína en la superficie de la célula bacteriana en evasión de la respuesta inmune del huésped fue confirmada usando una prueba de resistencia de suero con suero humano normal y vitronectina-agotado. La importancia de la vitronectina en la adhesión bacteriana se analizó utilizando portaobjetos de vidrio con y sin recubrimiento de vitronectina, seguido de la tinción de Gram. Por último, se investigó la adherencia bacteriana a las monocapas de células epiteliales alveolares humanas. Los protocolos descritos aquí pueden adaptarse fácilmente al estudio de cualquier especies bacterianas de interés.
Introduction
Vitronectina (Vn) es una importante glucoproteína humana implicados en el mantenimiento de la homeostasis a través de la regulación del sistema fibrinolítico. VN también funciona como un regulador del complemento mediante la inhibición de la vía del complemento terminal durante la formación de complejos de C5b6-7 y la polimerización de C9. Varios patógenos bacterianos se han demostrado para reclutar Vn a la superficie celular como medio de resistencia complemento deposición1,2,3. Además, Vn funciona como una molécula “sandwich” entre bacterias y receptores de las células epiteliales host, tal modo de promover la adhesión y la internalización de patógenos2,4,5. Unión de Vn a la superficie de la célula bacteriana está mediada por otras proteínas actualmente no identificados. Elucidar completamente el papel funcional de Vn-enlace de evasión de la respuesta inmune de la manguera por lo tanto requerirá identificación de proteínas Vn-reclutamiento.
El paso inicial en la identificación de proteínas de unión a Vn es probar si un patógeno de interés puede enlazar purificada Vn. flujo cytometry es un método conveniente y sencillo para determinar si Vn está limitado a las células del patógeno. En este estudio, se evaluó el atascamiento de Vn a varios Haemophilus influenzae tipo f (Hif) aislamientos clínicos6. El método descrito en este documento es cuantitativo y puede utilizarse para distinguir la capacidad de unión de una gran variedad de cepas bacterianas. En un estudio anterior hemos caracterizado proteína H (PH) de Hif como Vn vinculante proteínas7. Por lo tanto, en el presente estudio, el potencial de unión a Vn de los mutantes de tipo salvaje (WT) Hif y Hif M10Δlph se compararon utilizando los protocolos descritos.
Una vez que determine que un patógeno une Vn, el segundo paso es caracterizar el proteoma superficial con el fin de identificar potenciales proteínas Vn. Una variedad de enfoques se puede utilizar para este propósito8,9, pero estas metodologías no se describen en este informe. El método más adecuado para examinar las interacciones proteína-proteína es expresar las proteínas de la superficie bacterianas de e. coli por vía recombinante y purificar por cromatografía de afinidad. Aquí, utilizamos el PH y su interacción molecular con Vn para ilustrar el método. Interacciones entre recombinante PH y Vn se caracterizaron usando una enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA) de ensayo7 y una técnica recientemente desarrollada etiqueta-libre conocido como bio-capa interferometría (BLI)10,11. Mientras que Elisa puede utilizarse para confirmar las interacciones proteína-proteína, BLI proporciona datos detallados sobre los parámetros cinéticos de la interacción.
Para estudiar el papel funcional de Vn en la adhesión bacteriana, se pueden utilizar dos diferentes ensayos. El primer ensayo que se describe aquí es la medición directa de la adherencia bacteriana a las superficies de vidrio recubierto de Vn, mientras que el segundo ensayo examina adhesión a la superficie de las células epiteliales. Para el primer ensayo, portaobjetos fueron recubiertos con Vn y el atascamiento de WT o estirpes mutantes de Hif se evaluó por tinción de Gram y microscopía. Esta técnica distingue fácilmente las bacterias basadas en la capacidad de atar Vn12. Luego se analizó la adherencia bacteriana a las células de mamífero mediante la adición de bacterias cultivadas sobre una monocapa de células epiteliales alveolares de tipo II; fijación bacteriana se evaluó contando el número de la Colonia formando unidades (UFC). Bacterias adheridas e interiorizadas se pueden diferenciar en la presencia o ausencia de Vn4,13.
El papel de la adquisición de Vn en la resistencia bacteriana del suero fue evaluado usando un análisis de muerte de suero (es decir, la actividad bactericida del suero). Para evaluar la importancia de la adquisición de Vn en resistencia de suero, la actividad bactericida del suero Vn-agotado (VDS) se comparó con la del suero humano normal (NHS). El método utilizado fácilmente distingue Vn vinculante frente a bacterias no vinculante basadas en resistencia de suero. Utilizamos este método para estudiar el papel de Vn en la resistencia de suero de varios patógenos bacterianos4,12.
Se han reportado numerosos métodos para el estudio de las interacciones huésped-patógeno. Aquí, describimos un conjunto de protocolos que se pueden adaptar fácilmente al estudio de cualquier agente patógeno con el fin de evaluar el papel de Vn en patogenesia. Hemos probado estos protocolos utilizando diversos agentes patógenos, y Hif fue elegido como un ejemplo para este informe.
Protocol
Representative Results
Discussion
Patógenos bacterianos reclutan Vn a la superficie de la célula y utilizan este regulador complemento para evitar la deposición de los factores de complemento y completar el complejo de ataque de membrana2. VN también funciona como una molécula puente entre proteínas de la superficie bacterianas y receptores de superficie celular host, permitiendo así que los patógenos se adhieren a la superficie de las células epiteliales y posteriormente median internacionalización. En este estudio, se …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación de Anna y Edwin Berger, Lars Hierta, O.E. y Edla Johansson Foundation, el Consejo de investigación médica sueco (concesión número K2015-57 X-03163-43-4, www.vr.se), la Fundación de cáncer en la Universidad Hospital de Malmö, la sociedad fisiográfica (Fundación de Forssman) y del Consejo de Condado de Skåne investigación y Fundación para el desarrollo.
Materials
| 1.5 mL thermomixter | Eppendorf | 5355 | dry block heating and cooling shaker |
| 5 mL polystyrene round-bottom tube | BD Falcon | 60819-138 | 12 × 75 mm style |
| 5% CO2 supplied incubator | Thermo Scientific | BBD6220 | |
| 6 mL polystyrene round-bottom tube | VWR | 89000-478 | 12 × 75 mm style with cap |
| 24-well plates | BD Falcon | 08-772-1H | Cell culture grade |
| 30% Hydrogen peroxide (H2O2) solution | Sigma-Aldrich | H1009-100ML | Laboratory analysis grade |
| 75 cm2 tissue culture flask | BD Falcon | BD353136 | Vented |
| 96 well black flat bottom plate | Greiner Bio-One | 655090 | Tissue culture treated µClear black plates |
| A549 Cell Line human | Sigma-Aldrich | 86012804-1VL | |
| Cell detachment enzyme (Accutase) | Sigma-Aldrich | A6964-500ML | Cell Culture Grade |
| AR2G sensors | Pall Life Science | 18-5095 | Sensor to immobilized protein by amino coupling |
| Acetone | VWR | 97064-786 | Analysis grade |
| Bovine Serum Albumins (BSA) | Sigma-Aldrich | A2058 | Suitable for cell culture |
| Bibulous paper | VWR | 28511-007 | |
| Bio-layer interferometer | Pall Life Science | FB-50258 | Bilayer interferometry measuring equipment |
| Crystal violet solution | Sigma-Aldrich | HT90132-1L | |
| C4BP (C4b binding protein) | Complement Technology, Inc. | A109 | Bought as Frozen liquid form |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670-500G | |
| Carbol-fuchsin solution | Sigma-Aldrich | HT8018-250ML | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | 251275-500G | American Chemical Society (ACS) grade |
| Decolorizing solution | Sigma-Aldrich | 75482-250ML-F | |
| E. coli host (E. Coli BL21) | Novagen | 69450-3 | Protein expression host |
| F12 medium | Sigma-Aldrich | D6421 | Cell Culture Grade |
| Flow cytometer | BD Biosciences | 651154 | Cell analysis grade for research applications |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Sigma-Aldrich | 12003C | Suitable for cell culture |
| Normal human serum (NHS) | Complement Technology, Inc. | NHS | Pooled human serum |
| FITC-conjugated donkey anti-sheep antibodies | AbD Serotec | STAR88F | Polyclonal |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | Cell culture grade |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Suitable for cell culture |
| Hemocytometer | Marienfeld | 640210 | |
| HRP-conjugated anti-His tag antibodies | Abcam | ab1269 | Polyclonal |
| Human factor H | Complement Technology, Inc. | A137 | Bought as Frozen liquid form |
| C4BP | Complement Technology, Inc. | A109 | Frozen solution |
| Human serum albumin | Sigma-Aldrich | A1653-10G | lyophilized powder |
| Histidine affinity resin column (HisTrap HP) | GE Health Care Life Science | 17-5247-01 | Columns prepacked with Ni Sepharose |
| His-tagged PH | Recombinantly expressed and purified in our lab | ||
| Iodine solution | Sigma-Aldrich | HT902-8FOZ | |
| Methanol | VWR | BDH1135-1LP | Analysis grade |
| Microscope | Olympus | IX73 | Inverted microscope |
| Microscope slides | Sigma-Aldrich | S8902 | plain, size 25 mm × 75 mm |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266-1KG | |
| Plasmid containg C terminal 6x His-tag on the backbone (pET26(b)) | Novagen | 69862-3 | DNA vector |
| Polysorb microtitre plates | Sigma-Aldrich | M9410 | For ELISA |
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 6009 | American Chemical Society (ACS) grade |
| Sheep anti-human Vn antibodies | AbD Serotec | AHP396 | Polyclonal |
| Shaker | Stuart Scientific | STR6 | Platform shaker |
| Tissue culture flask | BD Falcon | 3175167 | 75 cm2 |
| Thermomixer | Sigma-Aldrich | T3317 | Dry block heating and cooling shaker |
| Tetramethylbenzidine | Sigma-Aldrich | 860336-100MG | ELISA grade |
| Vitronectin (Vn) from human plasma | Sigma-Aldrich | V8379-50UG | cell culture grade |
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