Dosages pour étudier le rôle de la vitronectine dans adhésion bactérienne et la résistance au sérum
Summary
Ce rapport décrit les protocoles pour caractériser les interactions entre les protéines de membrane externe bactérienne et la vitronectine régulateur de complément humain. Les protocoles peuvent être utilisés pour étudier les réactions de la liaison et la fonction biologique de la vitronectine dans n’importe quelle espèce bactérienne.
Abstract
Bactéries utilisent le complément régulateurs comme un moyen d’échapper à la réponse immunitaire hôte. Nous décrivons ici les protocoles d’évaluation de l’acquisition de vitronectine de rôle aux fois surface de cellule bactérienne dans la résistance pour le système immunitaire. Expériences de cytométrie de flux identifié la vitronectine plasma humain comme ligand pour la protéine de membrane externe du récepteur bactérien H d’Haemophilus influenzae type f. Un dosage immuno-enzymatique a été utilisé pour caractériser les interactions protéine-protéine purifiée de la protéine recombinante H mettant aux prises la vitronectine et affinité a été évaluée en utilisant l’interférométrie bio-couche. L’importance biologique de la liaison de la vitronectine à H la protéine à la surface des cellules bactériennes à l’évasion de la réponse immunitaire hôte a été confirmée à l’aide d’un test de résistance de sérum avec sérum humain normal et appauvri la vitronectine. L’importance de la vitronectine dans l’adhérence bactérienne a été analysée à l’aide de lames de verre, avec ou sans revêtement de vitronectine, suivie par la coloration de Gram. Enfin, l’adhérence bactérienne aux monocouches de cellules épithéliales alvéolaires humains a été étudiée. Les protocoles décrits ici peuvent être facilement adaptés à l’étude de toutes les espèces bactériennes d’intérêt.
Introduction
La vitronectine (Vn) est une glycoprotéine humaine importante impliqués dans le maintien de l’homéostasie par l’intermédiaire de la régularisation du système fibrinolytique. VN fonctionne aussi comme un régulateur de complément en inhibant la voie du complément terminal au cours de la formation d’un complexe C5b6-7 et la polymérisation de C9. Plusieurs bactéries pathogènes ont démontré que recruter Vn à la surface cellulaire comme moyen de résistance complément dépôt1,2,3. En outre, Vn fonctionne comme une molécule « sandwich » entre bactéries et récepteurs des cellules épithéliales hôte, favorisant ainsi l’adhérence et l’internalisation des pathogènes2,4,5. Liaison du Vn à la surface de la cellule bactérienne est véhiculée par d’autres protéines actuellement non identifiés. Élucider pleinement le rôle fonctionnel de Vn-liaison à l’évasion de la réponse immunitaire de tuyau exigera donc identification de protéines Vn-recrutement.
La première étape dans l’identification des protéines liant Vn est pour tester si un agent pathogène d’intérêt peut lier purifiée Vn. cytométrie en flux est une méthode pratique et simple pour déterminer si Vn est lié aux cellules de l’agent pathogène. Dans cette étude, nous avons évalué la liaison du Vn à divers Haemophilus influenzae type f (Hif) isolats cliniques6. La méthode décrite ici est quantitative et peut être utilisée pour distinguer la capacité de liaison d’une grande variété de souches bactériennes. Dans une étude précédente, nous avons caractérisé protéine H (PH) de Hif comme un liant Vn protéine7. Par conséquent, dans la présente étude, le potentiel de liaison Vn de mutants de type sauvage (WT) Hif et Hif M10Δ del/h ont été comparées en utilisant les protocoles décrits.
Lorsqu’il est déterminé qu’un pathogène lie Vn, la deuxième étape est de caractériser la surface proteome afin d’identifier des protéines liant le Vn potentiels. Une variété d’approches peut être utilisée pour ce but8,9, mais ces méthodes ne sont pas décrits dans le présent rapport. La méthode plus appropriée pour l’examen des interactions protéine-protéine est d’inoculation exprimer certaines protéines de surface bactériennes chez e. coli et purification par chromatographie d’affinité. Ici, nous utilisons des PH et ses interactions moléculaires Vn pour illustrer la méthode. Interactions entre recombinant PH et Vn furent caractérisées par une enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)7 et une technique récemment développée d’exempte d’étiquette appelée bio-couche interférométrie (BLI)10,11. Alors que les tests ELISA peuvent servir à confirmer les interactions protéine-protéine, BLI fournit des données détaillées sur les paramètres cinétiques des interactions.
Afin d’étudier le rôle fonctionnel de Vn en adhérence bactérienne, deux dosages différents peuvent être utilisés. Le premier test décrit ici est une mesure directe de l’adhérence des bactéries sur des surfaces de verre enduit de Vn, tandis que le deuxième test examine l’adhérence à la surface des cellules épithéliales. Pour le premier test, lames de verre ont été revêtus de Vn, et la liaison du WT ou souches mutantes de Hif a été évaluée par microscopie et coloration de Gram. Cette technique permet de distinguer facilement bactéries basés sur la capacité de lier Vn12. Adhérence bactérienne aux cellules de mammifères a été analysée puis en ajoutant des bactéries cultivées sur une monocouche de cellules épithéliales alvéolaires de la type II ; attachement des bactéries a été évaluée en comptant le nombre de formatrices unités (UFC). Collés et intériorisées de bactéries peuvent être distinguées en présence ou en absence de Vn4,13.
Le rôle de l’acquisition de Vn en résistance au sérum bactérienne a été évalué par dosage sérique meurtre (c’est-à-dire, l’activité bactéricide de sérum). Afin d’évaluer l’importance de l’acquisition de Vn dans la résistance au sérum, l’activité bactéricide du sérum appauvris en Vn (VDS) a été comparée à celle du sérum humain normal (NHS). La méthode utilisée facilement distingue liant Vn contre bactéries non contraignant basés sur la résistance au sérum. Nous avons utilisé cette méthode pour étudier le rôle de Vn dans la résistance au sérum de plusieurs bactéries pathogènes4,12.
De nombreuses méthodes ont été rapportés pour l’étude des interactions hôte-pathogène. Nous décrivons ici un ensemble de protocoles qui peuvent être facilement adaptés à l’étude de tout agent pathogène afin d’évaluer le rôle de Vn dans la pathogenèse. Nous avons testé ces protocoles à l’aide de différents agents pathogènes, et Hif a été choisi comme exemple pour ce rapport.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bactéries pathogènes recrutent Vn à la surface des cellules et d’utilisent ce régulateur de complément pour éviter les dépôts de facteurs du complément et l’achèvement du complexe membranaire attaque2. VN fonctionne aussi comme une molécule de pont entre les protéines de surface bactériennes et de récepteurs de surface cellulaire hôte, permettant ainsi des agents pathogènes d’adhérer à la surface des cellules épithéliales et par la suite servir de médiateur internalisati…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation d’Anna et Edwin Berger, Lars Hierta, O.E. et Edla Johansson Foundation, le Swedish Medical Research Council (accorder numéro K2015-57 X-03163-43-4, www.vr.se), la Fondation du Cancer à l’Université Hôpital de Malmö, la société physiographiques (de Forssman Fondation) et du Conseil de comté de Skåne Research and Development Foundation.
Materials
| 1.5 mL thermomixter | Eppendorf | 5355 | dry block heating and cooling shaker |
| 5 mL polystyrene round-bottom tube | BD Falcon | 60819-138 | 12 × 75 mm style |
| 5% CO2 supplied incubator | Thermo Scientific | BBD6220 | |
| 6 mL polystyrene round-bottom tube | VWR | 89000-478 | 12 × 75 mm style with cap |
| 24-well plates | BD Falcon | 08-772-1H | Cell culture grade |
| 30% Hydrogen peroxide (H2O2) solution | Sigma-Aldrich | H1009-100ML | Laboratory analysis grade |
| 75 cm2 tissue culture flask | BD Falcon | BD353136 | Vented |
| 96 well black flat bottom plate | Greiner Bio-One | 655090 | Tissue culture treated µClear black plates |
| A549 Cell Line human | Sigma-Aldrich | 86012804-1VL | |
| Cell detachment enzyme (Accutase) | Sigma-Aldrich | A6964-500ML | Cell Culture Grade |
| AR2G sensors | Pall Life Science | 18-5095 | Sensor to immobilized protein by amino coupling |
| Acetone | VWR | 97064-786 | Analysis grade |
| Bovine Serum Albumins (BSA) | Sigma-Aldrich | A2058 | Suitable for cell culture |
| Bibulous paper | VWR | 28511-007 | |
| Bio-layer interferometer | Pall Life Science | FB-50258 | Bilayer interferometry measuring equipment |
| Crystal violet solution | Sigma-Aldrich | HT90132-1L | |
| C4BP (C4b binding protein) | Complement Technology, Inc. | A109 | Bought as Frozen liquid form |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670-500G | |
| Carbol-fuchsin solution | Sigma-Aldrich | HT8018-250ML | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | 251275-500G | American Chemical Society (ACS) grade |
| Decolorizing solution | Sigma-Aldrich | 75482-250ML-F | |
| E. coli host (E. Coli BL21) | Novagen | 69450-3 | Protein expression host |
| F12 medium | Sigma-Aldrich | D6421 | Cell Culture Grade |
| Flow cytometer | BD Biosciences | 651154 | Cell analysis grade for research applications |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Sigma-Aldrich | 12003C | Suitable for cell culture |
| Normal human serum (NHS) | Complement Technology, Inc. | NHS | Pooled human serum |
| FITC-conjugated donkey anti-sheep antibodies | AbD Serotec | STAR88F | Polyclonal |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | Cell culture grade |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Suitable for cell culture |
| Hemocytometer | Marienfeld | 640210 | |
| HRP-conjugated anti-His tag antibodies | Abcam | ab1269 | Polyclonal |
| Human factor H | Complement Technology, Inc. | A137 | Bought as Frozen liquid form |
| C4BP | Complement Technology, Inc. | A109 | Frozen solution |
| Human serum albumin | Sigma-Aldrich | A1653-10G | lyophilized powder |
| Histidine affinity resin column (HisTrap HP) | GE Health Care Life Science | 17-5247-01 | Columns prepacked with Ni Sepharose |
| His-tagged PH | Recombinantly expressed and purified in our lab | ||
| Iodine solution | Sigma-Aldrich | HT902-8FOZ | |
| Methanol | VWR | BDH1135-1LP | Analysis grade |
| Microscope | Olympus | IX73 | Inverted microscope |
| Microscope slides | Sigma-Aldrich | S8902 | plain, size 25 mm × 75 mm |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266-1KG | |
| Plasmid containg C terminal 6x His-tag on the backbone (pET26(b)) | Novagen | 69862-3 | DNA vector |
| Polysorb microtitre plates | Sigma-Aldrich | M9410 | For ELISA |
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 6009 | American Chemical Society (ACS) grade |
| Sheep anti-human Vn antibodies | AbD Serotec | AHP396 | Polyclonal |
| Shaker | Stuart Scientific | STR6 | Platform shaker |
| Tissue culture flask | BD Falcon | 3175167 | 75 cm2 |
| Thermomixer | Sigma-Aldrich | T3317 | Dry block heating and cooling shaker |
| Tetramethylbenzidine | Sigma-Aldrich | 860336-100MG | ELISA grade |
| Vitronectin (Vn) from human plasma | Sigma-Aldrich | V8379-50UG | cell culture grade |
References
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