נייד דור גזע מושר מתאי דם באמצעות וירוס Sendai ו צנטריפוגה
Summary
We propose a protocol for reprogramming peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) into induced pluripotent stem cells (iPSCs). By plating the transduced blood cells onto matrix-coated plates with centrifugation, iPSCs are successfully induced from floating cells. This technique suggests a simple and effective reprogramming protocol for cells such as PBMCs and CBMCs.
Abstract
ההתפתחות האחרונה של תאי גזע מושרים אנושיים (hiPSCs) הוכיחה כי תאי סומטיים בוגרים יכולים לחזור למצב מובחן, פלוריפוטנטיים. עכשיו, תכנות מחדש נעשה עם סוגים שונים של תאי סומטיים מבוגרים: קרטינוציטים, תאים שתן, פיברובלסטים, וכו ניסויים מוקדמים בדרך כלל נעשו עם פיברובלסטים עורי. עם זאת, זה נדרש הליך כירורגי פולשני להשיג פיברובלסטים מן המטופלים. לכן, תאי השעיה, כגון תאי דם ושתן, נחשבו אידיאליים עבור תכנות מחדש בגלל הנוחות של קבלת התאים הראשוניים. כאן אנו מדווחים פרוטוקול יעיל עבור הדור iPSC מתאי דם היקפיים mononuclear (PBMCs). על ידי ציפוי PBMCs transduced סדר צנטריפוגה באמצעות צלחת חדשה, מצופה-מטריקס, פרוטוקול זה יכול בקלות לספק מושבות iPSC. שיטה זו היא גם החלימה על תאי mononuclear דם חבל טבור (CBMCs). מחקר זה מציג prot פשוטה ויעילהocol עבור תכנות מחדש של PBMCs ו CBMCs.
Introduction
תאי גזע היו אחד החומרים הכי האטרקטיביים בטיפול קליני עבור 1 העשורים האחרונים. המאפיינים האטרקטיביים של תאי גזע הם pluripotency והיכולת עצמי לחדש. בשנת 1981, את תאי הגזע העובריים הראשון (ESCs) נותקו מן העובר העכבר 2. עם זאת, כאשר הטכניקה יושמה כדי עוברי אדם, היא נתקלה בכמה סוגיות אתיות.
בשנת 2006, כאשר ד"ר יאמאנאקה וצוותו לתכנות מחדש תא פלוריפוטנטיים הראשון מן תאי הסומטיים עכבר, בתחום תאי גזע שהעלה האפשרות שלה וריבית התעוררה מחדש 3. ידי אספקת מספר גורמים מוגדרים, תאי גזע פלוריפוטנטיים היו בהצלחה "מושרים" מן התאים הסומטיים מבוגרים, ובכך נקראו "תאי גזע מושרים (iPSCs)." בשנת 2007, טכניקה זו יושמה תאים אנושיים 4, מניב תאים עם המאפיינים המדויקים של ESCs אבל אף אחד הדיון האתי. באופן תיאורטי, שב"סCs ניתן להפיק מכל סוג תא המתקבל כל יחיד או מטופל. חולה ספציפי iPSCs עולה ככלי פוטנציאלי שיכול לדמות את פנוטיפים המחלה ותנאי אפיגנטיים של כל מטופל ומטופל. באמצעות עריכת גן או שיטות אחרות שיכול להפוך את המצב פתוגניים, iPSCs מטופל ספציפי יכול לשמש גם ברפואה אישית 5. יתר על כן, iPSCs הם פחות קשור דחייה חיסונית כי יש להם את אותה זהות חיסונית כמו התורם, קבלת השתלה אוטומטית ריאלית יותר 6. לכן, iPSCs הפך הפלטפורמה המבטיחה ביותר דוגמנות מחלה, הקרנת סמים, וטיפולים רגנרטיבית. בהתחשב היתרונות הללו, פרוטוקולי שיפור שיכול לתת טהור ותשואות גבוהות יותר, בזמן הקצר ביותר ממקור התא הקטן הם כל זמן בפיתוח. שיקול מרכזי אחד למצוא את הפרוטוקול היעיל ביותר עבור יישום עתידי הוא סוג התא הראשוני. רוב פרוטו הדור iPSC מוקדםעמודות מותאמות עבור תאים חסידים מאז קווי iPSC המקוריים היו מושרה מן fibroblasts עור 4. עם זאת, בידוד והכנת תאים אלה הם עבודה אינטנסיבית. כמו כן, את הבידוד של פיברובלסטים עור כולל ניתוחים פולשניים שיכול להפוך חסרון גדול עבור יישום רחב יותר.
לכן, עבור המשך שימוש iPSCs, מקור תא עם רכישה נוחה נדרש. דם נחשב כמקור תא אידיאלי שכן הוא מתקבל באמצעות הליך די פולשנית 7-9. במחקר זה, פיתחנו שינוי פשוט לפרוטוקול יצירת hiPSCs מתאי דם היקפיים mononuclear (PBMCs). בהעדר תהליך ההתרחבות הקשה של סוג תא מסוים, כגון CD34 + תאים, תאי דם מלאים או PBMCs היו מצופה סדרתי לצלחות מצופת מטריצה על ידי צנטריפוגה לאחר התמרתי עם וירוס סנדאי המכיל גורמי יאמאנאקה. שיטה זו הקטינה את הזמן הדרושמצורף של תאים צפים transduced וירידה בהפסד של תאים לתכנות מחדש כי לא היו מסוגלים לצרף בכוחות עצמם.
Protocol
Representative Results
Discussion
מאחר ותאי גזע עובריים (ESCs) הראו כמה חסרונות, את הצורך של כלי חלופי נדרש. לכן, הפיתוח של תאי גזע מושרים (iPSCs) על ידי יאמאנאקה בא תחת אור הזרקורים הבינלאומיים. זה כבר כמעט עשור מאז יאמאנאקה גילתה כי pluripotency יכול להיגרם על ידי הוספה רק ארבעה גנים לתוך תאי סומטיים מבוגרים. מאז …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a grant from the Basic Science Research Program through the National Research Foundation of Korea (NRF), funded by the Ministry of Science, ICT, and Future Planning (2013R1A1A1076125).
Materials
| Plasticware | |||
| 100mm Dish | TPP | 93100 | |
| 6-well Plate | TPP | 92006 | |
| 50 mL Cornical Tube | SPL | 50050 | |
| 15 mL Cornical Tube | SPL | 50015 | |
| 10 mL Disposable Pipette | Falcon | 7551 | |
| 5 mL Disposable Pipette | Falcon | 7543 | |
| 12-well Plate | TPP | 92012 | |
| 24-well Plate | TPP | 92024 | |
| PBMC Isolation Materials | |||
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| Ficoll | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| StemSpan | STEMCELL Technologies | 9805 | Blood cell media |
| CC110 | STEMCELL Technologies | 8697 | Blood cell media supplement (100x) |
| iPSC Generation and Culture Materials | |||
| CytoTune-iPSC Sendai Reprogramming Kit | Life Technologies | A16518 | |
| TeSR-E8 Media | STEMCELL Technologies | 5940 | iPSC media |
| Vitronectin | Life Technologies | A14700 | |
| ROCK Inhibitor | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| TrypLE express (TrypLE) | Life Technologies | 12604-039 | |
| ReleSR | STEMCELL Technologies | 12604-039 | Colony detaching solution |
| Quality Control Materials | |||
| 18 mm Cover Glass | Superior | HSU-0111580 | |
| 4% Paraformaldyhyde | Tech & Innovation | BPP-9004 | |
| Triton X-100 | BIOSESANG | 9002-93-1 | |
| Bovine Serum Albumin | Vector Lab | SP-5050 | |
| Anti-SSEA4 Antibody | Millipore | MAB4304 | |
| Anti-Oct4 Antibody | Santa Cruz | SC9081 | |
| Anti-TRA-1-60 Antibody | Millipore | MAB4360 | |
| Anti-Sox2 Antibody | Biolegend | 630801 | |
| Anti-TRA-1-81 Antibody | Millipore | MAB4381 | |
| Anti-Klf4 Antibody | Abcam | ab151733 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11029 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11037 | |
| DAPI | Molecular Probe | D1306 | |
| Prolong gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | |
| Slide Glass, Coated | Hyun Il Lab-Mate | HMA-S9914 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 366919 | |
| Isoprypylalcohol | Millipore | 109634 | |
| Ethanol | Duksan | 64-17-5 | |
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit | Thermo Scientfic | K1622 | |
| i-Taq DNA Polymerase | iNtRON BIOTECH | 25021 | |
| UltraPure 10X TBE Buffer | Life Technologies | 15581-044 | |
| loading star | Dyne Bio | A750 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
| 1kb (+) DNA ladder marker | Enzynomics | DM003 | |
| Alkaline Phosphatase | Millipore | SCR004 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | Rinse Buffer |
| Sodium Chloride | Duchefa Biochemie | S0520.1000 | Rinse Buffer |
| Tween-20 | BIOSESANG | T1027 | Rinse Buffer |
| Hydrochloric Acid | Duksan | 1129 | Rinse Buffer |
References
- Serra, M., Brito, C., Correia, C., Alves, P. M. Process engineering of human pluripotent stem cells for clinical application. Trends Biotechnol. 30 (6), 350-359 (2012).
- Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 78 (12), 7634-7638 (1981).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Chun, Y. S., Byun, K., Lee, B. Induced pluripotent stem cells and personalized medicine: current progress and future perspectives. Anat Cell Biol. 44 (4), 245-255 (2011).
- Seki, T., Fukuda, K. Methods of induced pluripotent stem cells for clinical application. World J Stem Cells. 7 (1), 116-125 (2015).
- Churko, J. M., Burridge, P. W., Wu, J. C. Generation of human iPSCs from human peripheral blood mononuclear cells using non-integrative Sendai virus in chemically defined conditions. Methods Mol Biol. 1036, 81-88 (2013).
- Loh, Y. H., et al. Reprogramming of T cells from human peripheral blood. Cell Stem Cell. 7 (1), 15-19 (2010).
- Ohmine, S., et al. Induced pluripotent stem cells from GMP-grade hematopoietic progenitor cells and mononuclear myeloid cells. Stem Cell Res Ther. 2 (6), (2011).
- Mae, S., et al. Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells. Nat Commun. 4, 1367 (2013).
