Sendai Virüs ve santrifüj kullanılarak Kan Hücreleri indüklenmiş pluripotent kök hücre Üretimi
Summary
We propose a protocol for reprogramming peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) into induced pluripotent stem cells (iPSCs). By plating the transduced blood cells onto matrix-coated plates with centrifugation, iPSCs are successfully induced from floating cells. This technique suggests a simple and effective reprogramming protocol for cells such as PBMCs and CBMCs.
Abstract
İnsan uyarılmış pluripotent kök hücreler (hiPSCs) son gelişme olgun somatik hücreler farklılaşmamış bir, pluripotent duruma geri kanıtladı. İlk deneyler, genellikle deri fibroblast ile yapıldı vb keratinositler, idrar hücreler, fibroblastlar, Şimdi, yeniden programlama çeşitli yetişkin somatik hücre tipleri ile yapılır. Ancak, bu hastaların fibroblastlar elde etmek için invazif cerrahi prosedür gerekli. Bu nedenle, kan ve idrar hücreleri gibi süspansiyon hücreleri, çünkü birincil hücreler elde rahatlık yeniden programlama için ideal olarak kabul edildi. Burada, periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMC) için iPSC üretilmesi için etkili bir yöntem sunulmaktadır. Yeni, matris kaplı plaka kullanılarak santrifüj seri olarak transduced PBMC'ler kaplama olarak, bu protokol kolayca iPSC koloniler sağlayabilir. Bu yöntem aynı zamanda göbek kordonu kan tek-çekirdekli hücreleri (CBMCs) için de geçerlidir. Bu çalışma, basit ve etkili bir Prot sunarPBMC'ler ve CBMCs yeniden programlanmasını ocol.
Introduction
Kök hücreleri, son birkaç on yıl 1 Klinik terapisinde en cazip malzemelerden biri olmuştur. Kök hücrelerin çekici özellikleri Pluripotency ve kendini yenilemek yeteneği vardır. 1981 yılında ilk embriyonik kök hücrelerin (ESCs) fare embriyo 2 izole edilmiştir. teknik insan embriyosunun uygulanmıştır Ancak, birkaç etik konuları karşılaştı.
Dr. Yamanaka ve ekibi fare somatik hücrelerden ilk pluripotent hücre reprogrammed zaman 2006 yılında, kök hücre alanı kendi imkanı kazanmış ve faiz 3 canlanan edildi. Birkaç tanımlanmış faktörleri teslim ederek, pluripotent kök hücreler başarıyla yetişkin somatik hücrelerden "uyarılmış" olduğunu ve böylece adlandırılmıştır "(iPSCs) uyarılmış pluripotent kök hücreler." 2007 yılında, bu teknik EKH kesin özelliklere sahip hücreler üreterek, insan hücrelerinde 4 uygulanmış fakat etik tartışmaların hiçbiri. Teorik olarak, iPSCs herhangi bir birey veya hastadan elde edilen herhangi bir hücre tipinden oluşturulabilir. Hastaya özel iPSCs hastalık fenotipleri ve her hastanın epigenetik koşullarını taklit edebilirsiniz potansiyel bir araç olarak artıyor. Gen düzenleme veya patojenik durumu tersine çevirmek için başka yöntemler kullanılarak, hastaya özel iPSCs, kişiselleştirilmiş ilaç 5 kullanılabilir. Bunlar 6 otomatik nakli daha uygun hale verici ile aynı bağışıklık kimliğe sahip çünkü Ayrıca, iPSCs az bağışıklık reddi ile ilişkilidir. Bu nedenle, iPSCs hastalık modelleme, ilaç tarama ve rejeneratif tedaviler en umut verici bir platform haline gelmiştir. Bu faydaları, sürekli geliştirilmekte olan küçük hücre kaynağından zaman az miktarda daha saf ve daha yüksek verim verebilir geliştirilmiş protokoller göz önüne alındığında. Gelecekteki uygulama için en verimli protokol bulma biri önemli unsurlardan primer hücre tipidir. Erken iPSC üretimi proto çoğucols orijinal iPSC hatları deri fibroblastları 4 indüklenen beri yapışık hücreler için optimize edilmiştir. Bununla birlikte, bu hücrelerin izole edilmesi ve hazırlanması, emek yoğun işlemlerdir. Ayrıca, cilt fibroblast izolasyonu daha geniş bir uygulama için büyük bir eksiklik olabilir invaziv cerrahi prosedürleri içermektedir.
Bu nedenle, iPSCs ve daha fazla kullanım için, uygun edinimi ile bir hücre kaynağı gereklidir. Bu oldukça minimal invaziv prosedür 7-9 ile elde edilir çünkü kan ideal bir hücre kaynağı olarak kabul edilir. Bu çalışmada, periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMC) için hiPSCs üreten protokole basit modifikasyon geliştirdi. Bu CD34 + hücreleri gibi belirli bir hücre tipi, zor genişletme işlemi olmadan, tam kan hücreleri veya PBMC'ler seri Yamanaka faktörleri içeren Sendai virüsü ile transdüksiyon sonra santrifüjleme ile matris kaplı plakalar üzerine kaplandı. Bu yöntem için gerekli süre azalırtransduse yüzen hücreleri bağlanma ve kendi eklemek mümkün değildi yeniden programlanan hücrelerin kaybı azalmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Embriyonik kök hücreler (ESCs) birçok takım eksiklikler göstermiştir için, alternatif bir araca gerek gerekmiştir. Bu nedenle, Yamanaka tarafından uyarılmış pluripotent kök hücrelerinin gelişimi (iPSCs) uluslararası mercek altına geldi. Yamanaka Pluripotency yetişkin somatik hücre içine sadece dört gen ekleyerek uyarılan edilebileceğini keşfetti beri neredeyse on yıl olmuştur. iPSCs olgun somatik hücrelerden "uyarılmış" olduklarından, bir zamanlar EKH ilgili endişe olmuştu etik…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a grant from the Basic Science Research Program through the National Research Foundation of Korea (NRF), funded by the Ministry of Science, ICT, and Future Planning (2013R1A1A1076125).
Materials
| Plasticware | |||
| 100mm Dish | TPP | 93100 | |
| 6-well Plate | TPP | 92006 | |
| 50 mL Cornical Tube | SPL | 50050 | |
| 15 mL Cornical Tube | SPL | 50015 | |
| 10 mL Disposable Pipette | Falcon | 7551 | |
| 5 mL Disposable Pipette | Falcon | 7543 | |
| 12-well Plate | TPP | 92012 | |
| 24-well Plate | TPP | 92024 | |
| PBMC Isolation Materials | |||
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| Ficoll | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| StemSpan | STEMCELL Technologies | 9805 | Blood cell media |
| CC110 | STEMCELL Technologies | 8697 | Blood cell media supplement (100x) |
| iPSC Generation and Culture Materials | |||
| CytoTune-iPSC Sendai Reprogramming Kit | Life Technologies | A16518 | |
| TeSR-E8 Media | STEMCELL Technologies | 5940 | iPSC media |
| Vitronectin | Life Technologies | A14700 | |
| ROCK Inhibitor | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| TrypLE express (TrypLE) | Life Technologies | 12604-039 | |
| ReleSR | STEMCELL Technologies | 12604-039 | Colony detaching solution |
| Quality Control Materials | |||
| 18 mm Cover Glass | Superior | HSU-0111580 | |
| 4% Paraformaldyhyde | Tech & Innovation | BPP-9004 | |
| Triton X-100 | BIOSESANG | 9002-93-1 | |
| Bovine Serum Albumin | Vector Lab | SP-5050 | |
| Anti-SSEA4 Antibody | Millipore | MAB4304 | |
| Anti-Oct4 Antibody | Santa Cruz | SC9081 | |
| Anti-TRA-1-60 Antibody | Millipore | MAB4360 | |
| Anti-Sox2 Antibody | Biolegend | 630801 | |
| Anti-TRA-1-81 Antibody | Millipore | MAB4381 | |
| Anti-Klf4 Antibody | Abcam | ab151733 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11029 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11037 | |
| DAPI | Molecular Probe | D1306 | |
| Prolong gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | |
| Slide Glass, Coated | Hyun Il Lab-Mate | HMA-S9914 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 366919 | |
| Isoprypylalcohol | Millipore | 109634 | |
| Ethanol | Duksan | 64-17-5 | |
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit | Thermo Scientfic | K1622 | |
| i-Taq DNA Polymerase | iNtRON BIOTECH | 25021 | |
| UltraPure 10X TBE Buffer | Life Technologies | 15581-044 | |
| loading star | Dyne Bio | A750 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
| 1kb (+) DNA ladder marker | Enzynomics | DM003 | |
| Alkaline Phosphatase | Millipore | SCR004 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | Rinse Buffer |
| Sodium Chloride | Duchefa Biochemie | S0520.1000 | Rinse Buffer |
| Tween-20 | BIOSESANG | T1027 | Rinse Buffer |
| Hydrochloric Acid | Duksan | 1129 | Rinse Buffer |
References
- Serra, M., Brito, C., Correia, C., Alves, P. M. Process engineering of human pluripotent stem cells for clinical application. Trends Biotechnol. 30 (6), 350-359 (2012).
- Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 78 (12), 7634-7638 (1981).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Chun, Y. S., Byun, K., Lee, B. Induced pluripotent stem cells and personalized medicine: current progress and future perspectives. Anat Cell Biol. 44 (4), 245-255 (2011).
- Seki, T., Fukuda, K. Methods of induced pluripotent stem cells for clinical application. World J Stem Cells. 7 (1), 116-125 (2015).
- Churko, J. M., Burridge, P. W., Wu, J. C. Generation of human iPSCs from human peripheral blood mononuclear cells using non-integrative Sendai virus in chemically defined conditions. Methods Mol Biol. 1036, 81-88 (2013).
- Loh, Y. H., et al. Reprogramming of T cells from human peripheral blood. Cell Stem Cell. 7 (1), 15-19 (2010).
- Ohmine, S., et al. Induced pluripotent stem cells from GMP-grade hematopoietic progenitor cells and mononuclear myeloid cells. Stem Cell Res Ther. 2 (6), (2011).
- Mae, S., et al. Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells. Nat Commun. 4, 1367 (2013).
