抗体フラグメントのライブラリーをスクリーニングするための細菌インナー膜を表示

1. ssTorAシグナル配列に融合としてのscFvライブラリーを作製 scFv遺伝子の変異体を含むデオキシリボ核酸（DNA）ライブラリーを得ます。 注：ライブラリはまた、全体のscFv遺伝子または標的ドメインにわたる多様性を生成するために、任意の適切なモードを使用して構築することができる22（ 例えば 、領域の3つの相補性決定、のCDR3。）。 標準的な分子クローニング法23を使用してPIMDプラスミド（ 図2）にDNAライブラリーを挿入します。 注：このプラスミドは（のscFvのN末端）ssTorAシグナル配列に遺伝子融合およびFLAGエピトープタグ（のscFvのC末端）としてscFvを発現します。内膜のディスプレイのためのプラスミドの設計は、これまで19に記載されています。 PIMDプラスミドは、著者から入手可能です。 <br/> 図2.インナー膜ディスプレイプラスミド（PIMD）マップ（1.3を介してステップ1.2）。このプラスミドは、lacプロモーター、複製のColE1起点、およびクロラムフェニコール耐性遺伝子を含みます。挿入されたscFv遺伝子は、同じリーディングフレーム内に3つのすべてで、Tat経路およびFLAGエピトープタグへのscFvを標的とするssTorAシグナル配列に融合されます。制限酵素部位が示されています。 XbaIおよびNotI制限酵素部位の間に挿入ライブラリーのために、プラスミドの大きさは2219 bpのプラスscFvの大きさである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 MC4100 大腸菌にライブラリを含むプラスミドDNAをトランスフォームcoli細胞を 23。このライブラリの細菌の形を回復し、成長します。 RTで15分間、4000×gで遠心分離し、細胞を回収しました。上清を除去し、回収した細胞を再懸濁ルリア – ベルターニ（LB）培地中で、25％グリセロールです。必要になるまで-80℃でアリコートを保存、またはステップ2に進みます。 注：プロトコルは、他のE.ものの、MC4100細胞で確認されています大腸菌株は、プロトコルと互換性があることが予想されます。エレクトロポレーションは、高い形質転換効率による形質転換のための好ましい方法です。ライブラリーは、典型的には少なくとも10 scFvは、この段階での変異体9から構成されなければならない、と各アリコートは、ライブラリが100倍に覆われているように、十分な細胞が含まれている必要があります。 2.ライブラリを表現し、スフェロプラストを準備 RTで（ステップ1.3から）は、細菌ライブラリーの1つのアリコートを解凍し、20μg/ mlのクロラムフェニコール（CM）と100ミリリットルのLB培地を含むフラスコにアリコートを追加します。 37°Cとインキュベートシェーカーで225rpmで3時間成長します。 3時間後、37°C​​からフラスコを取り外し、シェーカーをインキュベートしました。にscFvライブラリーの発現を可能にします20℃で15〜22時間インキュベートシェーカーで225rpmでのためにO / Nを進みます。 注：PIMDプラスミドを使用した場合、プロモーターが漏れやすいようませ誘導物質は、必要ありません。 MC4100細胞はLacリプレッサーを過剰発現していない（とのLacIがプラスミド上に発見されていない）ことに注意してください。 図3. 大腸菌 細胞及びスフェロプラスト（A）E. coli細胞の形状は円筒形です。 （B） EDTA及びリゾチーム、 大腸菌の外膜を使用してスフェロプラスト後大腸菌細胞が破裂され、そして得られたスフェロプラストは、形状が球状です。微分干渉コントラスト（DIC）顕微鏡画像は、倒立顕微鏡で100倍の対物レンズを用いて得られたくださいCこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをなめます。 ライブラリースフェロプラストを準備します。 注：スフェロプラストは、Eの外膜を破裂させることによって形成されますcoliおよび形状が球状である（ 図3）。 必要な緩衝液を準備します。 注：すべての緩衝液は、無菌であるべきです。 蒸留水1,000 mlの最終容量に2 O 2 PO 4 HPO 4 8gのNaCl、0.2gのKCl 1.44 G 2ナトリウムを溶解し;（pH7.4のPBS）、0.24グラムのKH 1×リン酸緩衝生理食塩水を準備します。氷の上に保管してください。 200 ML 1×PBS中に0.2グラムのBSAを溶解し、0.1％（w / v）のウシアルブミン血清（BSA）を含むPBSを準備します。氷の上に保管してください。 滅菌濾過した1 Mのショ糖、1 Mトリス緩衝液（pH8.0）、1.5mlの1 mlの蒸留H 2 O 7.5 mlと混合することによって分画バッファ（FB）を調製氷の上に保管してください。 30μlのOを添加することによって、1mMのエチレンジアミン四酢酸（EDTA）を調製H 2 Oを蒸留F 0.5 M EDTAを14.97ミリリットル H 2 Oを100mlの蒸留中に4.76グラムのMgCl 2を溶解し、0.5MのMgCl 2を準備氷の上に保管してください。 シェーカーからフラスコを取り出し、細胞密度を決定するために、分光光度計を用いて600nmでの光学密度（OD）を測定します。誘導された培養物の容量は、スフェロプラストのために、各サンプルは、1×10 10細胞を有するように必要に応じて計算します。 注：E. 10 9細胞/ mlの濃度を示す1のOD 600の近似大腸菌は 、24を使用することができます。 5分間遠心室温で12,000×gで1.5ミリリットルマイクロチューブにおける誘導文化の計算されたボリューム。問題は、サンプル調製に生じた場合には、少なくとも二つのサンプルを準備します。 遠心分離培養物から上清を除去し、氷冷FB100μlの各細胞ペレットを再懸濁します。 12,000×で遠心分離1分間室温でグラム、その後、ピペットで上清を除去します。氷冷FB350μlの再懸濁各ペレットは、10mg / mlのリゾチームの3.5μlのを補いました。 ゆっくりと、1 mMのEDTAの700μLを滴下しながら、各チューブをボルテックスし、ゆっくりとサンプルを混合するためにチューブ回転で回転させながら室温で20分間チューブをインキュベートします。回転子からチューブを取り外し、各チューブに氷冷した0.5 MのMgCl 2の50μlを添加し、10分間氷上でインキュベートします。遠心分離機10分間、4℃で11,000×gでチューブ。 スフェロプラストペレットを分離します。 ゆっくりとペレットの一部をプルアップするために1ミリリットルの先端でマイクロピペットを使用してください。直接新しい1.5 mlチューブ上部の開口部との角度でチューブを保持しながら、ゆっくりと上清のうち、ピペットチップを持ち上げ、新しいチューブにペレットをスライドさせます。 上清の重要なボリュームが新しいチューブに移している場合は、ピペットでそれを削除します。ペレットは、企業ENOされていない場合ぐふ2分間11,000×gで、再遠心分離を転送し、再びペレットの分離を試みます。 氷冷1×PBS 1 mlに各チューブ内のスフェロプラストペレットを再懸濁します。ピペッティングし、ペレットを完全に再懸濁されるまで、ゆっくりと渦ホルダーにボルテックスの間で代替。一度に複数の2分間氷のオフにサンプルを維持し、再び氷から削除する前に少なくとも5分間氷上に戻らないでください。ステップ4でパンニングに使用するまで（最大2日間）4℃でスフェロプラストを保管してください。 3.磁気ビーズ上に標的抗原を固定化 大腸菌中での組換え産生中にin vivoで標的抗原をビオチン化coli細胞。また、化学的結合25または既にビオチン化された購入対象抗原を使用し、3.2に進みます。 10×ビシンバッファを作るために50ミリリットルの水に816グラムのビシンを追加します。 BUFを希釈50°Cまでの蒸留H 2 Oと暑さの中で1×にFER。 10mMのビシン緩衝液中の5 mMのビオチンはビオチン溶液を作るために加熱された1×ビシンバッファの12ミリリットルに14.7 mgのビオチンを追加します。必要になるまで-20℃で保管してください。 ビオチンカルボキシルキャリアタンパク質（BCCP）への融合として、標的抗原の産生を可能にするpAK400cb-BCCPプラスミド26を用いて、標的タンパク質を発現し、ビオチン化。 注：E. coli細胞ネイティブビオチニル化BCCP、精製および化学的に前ストレプトアビジンでコーティングしたビーズへの固定化に標的タンパク質をビオチン化する必要がなくなります。ネイティブE.大腸菌ビオチンリガーゼBirAを、融合タンパク質をビオチン化するために十分です。 E.を育てますで振盪しながら37℃で20 / mlのCmを用いて補充したLB培地5ml中に15〜18時間（BCCPのN末端への融合物として挿入された標的抗原を有する）ビオチン化プラスミドO / Nを含有する大腸菌 225 rpmで。 分光光度計を用いて600nmでODを測定し、必要な文化の体積を計算（V アド ）式を用いて20μgの/ mlのCmを用いて25ミリリットル中0.05の開始OD新鮮なLB培地で継代培養する：V（= 0.05×を追加 25ミリリットル）/（OD 600 – OD 600は、O / N培養およびV アドオンの光学密度である0.05）は、新鮮なLBに追加するO / N培養の体積でありますサブカルチャーとは、37℃、225rpmでインキュベートシェーカーで0.8に0.5のODまで成長します。 5μMの最終濃度100μMとビオチンの最終濃度までイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシドを追加します。 20°Cおよび225 rpmで15〜22時間インキュベートシェーカーで発現を誘導します。 10分間、4℃で4000×gで遠心分離によって収穫細菌。上清を取り除きます。使用するまで-20℃でペレットを保管してください。 加えます細胞ペレットを0.2g当たり細胞溶解界面活性剤を1ml。ピペッティングにより再懸濁し、穏やかに細胞を溶解するために20分間回転させます。溶解した後、16,000×gで遠心分離し、20分間、4°C。新しい1.5 mlチューブに可溶性ライセート（上清）をピペットで。 未結合ビオチンを除去するために、3 kDaの分子量カットオフの列を使用します。製造元の指示に従って、20℃でカラムにライセート、および遠心分離機をピペット。溶解産物中のビオチンは、100倍に希釈され、洗浄溶解物の体積は、溶解物の元の容積に等しくなるまで1×PBSで洗浄します。新しいチューブにライセートを移します。 ストレプトアビジン被覆磁気ビーズ上にビオチン化標的抗原を固定化します。 ステップ2.3.1で説明したように1×PBSおよびBSA（w / v）の0.1％と1×PBSを準備します。 磁気ビーズを準備します。 注：これは、磁気分離ラックの使用を必要とします。 再懸濁streptav元のバイアル中の磁性ビーズをidinがコーティングされました。または少なくとも30秒間のいずれかボルテックスで5分間回転させます。 1.5mlチューブに7-10×10 9ビーズを転送します。 注：必要な容量は、製造業者によって供給されたビーズ濃度に依存することになります。 チューブの側面にビーズを収集するために2分間磁石ラックのビーズを含むチューブを置きます。まだ磁石にチューブを、慎重にビーズを中断することなく、ピペットで上清を除去します。 洗浄するために、磁石からチューブを削除し、気泡を発生させずにピペットで1×1mlのPBSにビーズを再懸濁します。ビーズを収集するために2分間磁石にチューブを戻し、慎重にピペットで上清を除去します。合計3回の洗浄のためのプロセスをさらに2回繰り返します。何の液体が最終洗浄後にチューブ内に残っていないことを確認してください。 磁気BEAにビオチン化抗原を含む溶解液を追加します。DS。 磁石からチューブを外し、（ステップ3.1.5から）溶解物の1ミリリットル中のビーズを再懸濁します。静かに回転させながら室温で30分間インキュベートします。 抗原被覆ビーズを収集するために3分間磁石上にチューブを置きます。ステップ3.2.2.4に3.2.2.3に記載したのと同じ方法で0.1％のBSAを用いて1×PBSでコーティングされたビーズを5回洗浄します。最終洗浄後、ステップ3.2.2.2で使用したのと同じ量まで0.1％BSAで1×PBS中でビーズを再懸濁します。 固定された標的抗原は4℃で安定している場合は、パニングのために必要とされるまで、4℃でコーティングしたビーズを格納します。それ以外の場合は、ステップ4に進みます。 4.画面のターゲット抗原に対するパニングによってscFvをライブラリ（図4） 図4パニング（ステップ4）。抗原被覆磁性ビーズは、AReは、抗体ライブラリーの変異体を発現スフェロプラストとインキュベートしました。ビーズに結合したスフェロプラストからプラスミドDNAを回収し、ELISAベースの二次スクリーニングを用いてスクリーニングされたサブライブラリを生成するために使用されます。対応するプロトコルのステップが記載されています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 スフェロプラストでコーティングしたビーズをインキュベートします。 約5の比率をビーズにスフェロプラストを使用してください：1。滅菌15mlチューブに4×10 9スフェロプラストと8×10 8ビーズを追加します。 注：濃度はまだ1×10 10スフェロプラスト/ mlとなるように何の細胞は、スフェロプラストの処理中に失われなかったと仮定します。 4ミリリットルに全量を0.1％BSAで1×PBSを追加します。 1ミリリットルそれぞれ有する4つの1.5ミリリットルチューブに小分けし。静かに回転させながら5時間4℃で反応をインキュベートします。 広報ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）のためのビーズに結合したスフェロプラストをepare。 3分間磁石上にパンニング反応チューブを置きます。ピペットで上清を除去し、3.2.2.4にステップ3.2.2.3で説明したのと同様に、0.1％BSAで冷1×PBS氷でビーズに結合したスフェロプラストを4回洗浄します。蒸留H 2 Oの25μlの各管中のビーズに結合したスフェロプラストを再懸濁し-20℃でビーズを格納または4.3に進みます。 ビーズに結合したscFvの遺伝子を含むプラスミドを増幅するために、ビーズに結合したスフェロプラストの全プラスミドPCRを行います。 5'CCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTG3 '（フォワードプライマー）と5'TAGCTCTTGATCCGGCAAACAAA3'（リバースプライマー）：以下の配列を有するプライマーを取得します。 注：これらは、エンドツーエンドのPIMDプラスミドの反対の鎖に（ 図2）に結合し、PIMDの共通の特徴にアニールするように設計されているので、増幅はかかわらず発生しますscFv変異体配列。 プライマーをリン酸化します。 注：リン酸化がなければ、再ライゲーションは発生しません。プライマーはまた、むしろ、このプロトコルでは、このリン酸化方法を使用するよりも、5'-リン酸化と一緒に注文することができます。 表1に記載されているように0.5ミリリットルのチューブでは、フォワードPCRプライマーのためのリン酸化反応を設定します。逆方向プライマーのためにこのプロセスを繰り返します。 37℃で1時間反応をインキュベートします。そして、T4ポリヌクレオチドキナーゼ（PNK）を無効にするには20分間65℃でそれらをインキュベートします。 -20℃でリン酸化プライマーを保管してください。 PCRを行います。 表2に記載したようにPCRチューブに、PCR反応を準備します。 注：複数の反応はより高い収率のために調製することができます。未使用のビーズに結合したスフェロプラストは、-20℃で保存することができます。 完全な溶解を確実にするためにサーマルサイクラーで15分間、98℃でPCR反応を加熱スフェロプラストの。サーマルサイクラーからチューブを外し、それぞれに高忠実度ポリメラーゼの0.5μlを添加します。サーマルサイクラーにチューブを戻し、 表3に詳述したプログラムを使用して実行します。 適切なPCR産物をプール。 -20℃で保存したり、4.4に進みます。 表1 PNKのリン酸化反応（ステップ4.3.2.1）。 試薬 容量（μL） 蒸留H 2 O 15 10×T4 DNAリガーゼ反応バッファー 2 100μMプライマー 2 T4ポリヌクレオチドキナーゼ（PNK） 1 1 "FO：キープで-next.within-ページ="常に"> 表2】全プラスミドPCR反応（ステップ4.3.3.1）：「キープtogether.within-ページ= FO" ENT。 試薬 容量（μL） 蒸留H 2 O 28.5 5倍の高忠実度ポリメラーゼ緩衝液 10 10μMのリン酸化のフォワードプライマー 2.5 10μMのリン酸化リバースプライマー 2.5 40mMのdNTPミックス（10 mMの各dNTP） 1 ビーズに結合したスフェロプラスト 5 表3のPCRプログラム（ステップ4.3.3.2）。 <tbody> ステップ 温度（℃） 時間（分：秒） サイクル数 初期変性 98 0時30分 1 変性 98 0時10分 35 アニーリング 69 0時30分拡張 72 キロバイトあたりの夜12時30分最終エクステンション 72 6時 1 ホールド 12 無限 1 再環状化全プラスミドPCR産物を、およびMC4100 大腸菌を形質転換するためにライゲーションされた製品を使用coli細胞。 アガロースゲル23のPCR反応を実行してゲル23にDNAを染色し、使用して、PCR産物を精製し製造業者によって供給された指示に従うことによって線状化プラスミドを精製するためのゲルクリーンアップキット。 260nmで分光光度計を用いて濃度を測定します。必要になるまで-20℃で精製した断片を保存、または4.4.2に進みます。 PCR産物からのプラスミドを再環状化。 PCR産物の分子間ライゲーションを防止するために、PCR産物の1ng /μLの低濃度27との連結反応を行います。この濃度で800μlのライゲーション反応を調製するために必要な体積を計算します。 氷上でライゲーション反応を準備します。チューブでは、800μlのまでのPCR産物のステップ4.4.2.1で計算されたボリューム、10×DNAリガーゼ緩衝液80μlの、そして蒸留H 2 Oを追加します。 T4 DNAリガーゼの4μlを添加し、直ちに水浴またはサーマルサイクラー中で16℃でチューブを配置します。 14〜18時間、16°CO / Nでインキュベートします。 -20°Cで完了連結反応を保管してください必要になるまで、または4.4.3に進みます。 DNAリガーゼを加熱、不活性化するために15分間65℃でヒートブロック上のライゲーション反応を置きます。その後、連結したDNAを、塩を解除するために微小透析膜やDNAクリーンアップキットを使用します。 20℃で保存するか、または4.4.4に進みます。 MC4100 大腸菌を形質転換するために全体の熱不活性化、脱塩漬け連結産物を使用してくださいcoli細胞を 23。 -80℃で、得られたパンニングサブライブラリを含む細胞、および店舗のアリコートを、ステップ1.3で説明したように、グリセロールストックを準備します。 サブライブラリ上の第二のパンニングを行うために、ステップ4.4.4からのアリコートを使用してその全体を繰り返し、ステップ4。 注：第二のパンは、標的抗原19に良好に結合するライブラリーの成分を濃縮することができます。 5.さらなる特徴付けのために有望なクローンを同定するために酵素結合免疫吸着アッセイ法を用いた二次スクリーニングを行います（図5）</ P> 図5 ELISAに基づく二次スクリーニング（ステップ5）。パンニング中富化サブライブラリから（A）ライブラリの変異体は、増殖および発現のための培養プレートの個々のウェルに接種します。 （B）ELISAプレートを、標的抗原で被覆されています。 （C）ライブラリの変異体は、プロトコルに記載のELISAベースの二次スクリーニングを用いてスクリーニングされます。二次スクリーニングから得られたデータの分析に、興味のある変異体が選択され、さらに特徴付けられます。対応するプロトコルのステップが記載されています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 LB寒天プレート上にプレート（ステップ4.4.4から）パンニングサブライブラリーの1のチューブを解凍します。プレートいくつかの希釈（ – 10〜6倍希釈液を例えば 、10 2）個々のコロニーを確保するのに十分低い濃度で。 37℃で15〜18時間、プレートをインキュベートします。 4℃でプレートを保管または5.2に進みます。 パンニングサブライブラリーからコロニーを培養し、誘導します。無菌条件下でのすべての手順を実行します。 96ウェルプレートを伴う工程のためのマルチチャンネルピペッターを使用してください。 丸底96ウェル培養プレートの各ウェルに20 / mlのCmを含むLBの200μLを加えます。 、ピペットチップで寒天プレートからの個々のコロニーを採取し、96ウェルプレートの最初のウェルにチップを置き、静かに接種するためにかき混ぜます。各ウェルのための新しいチップを使用してください。各ウェルに1つのコロニーを接種します。対照として、接種していないコロニーとよく少なくとも一つの無菌性のコントロールが含まれています。 いくつかの96ウェルプレートに接種し、ステップ5.2.1と5.2.2を繰り返します。 310 rpmでマイクロプレートシェーカー上で96ウェルプレートを置きます。 37インキュベート6; 20〜24時間のためのCは、scFvを発現させること。 ステップ5.2で調製した各培養プレート、標的抗原でコート1、96ウェルELISAプレートのために。 コーティング溶液を作るために1×PBSで適切な濃度（4 / mlのに例えば、1μgの/ mlの）に精製された標的抗原を希釈します。各96ウェルプレートのためのコーティング溶液5mlを加えます。 注：適切な濃度は、使用されている特定の抗原に依存し、調整する必要があります。 96ウェル高結合クリアポリスチレンELISAプレートの各ウェルにコーティング溶液50μlを加えます。静かに、各ウェルの全表面がコーティングされていることを確認するために、ベンチトップ面にプレートをタップします。各プレートについて、この手順を繰り返します。 4°CO / Nでプレートをインキュベートします。 寒天プレート上に96ウェル培養プレートからコロニーを複製します。 liquの少量を収集するために培養プレートのウェルに滅菌ポリスチレンレプリケータを配置ID。慎重にレプリケータを上げ、すべての先端が板に触れているように、15cmのLB寒天プレートに移します。液体が移転した後は、レプリケータをまっすぐに持ち上げます。各培養プレートのために繰り返します。 さらなる特性が所望されるならば、96ウェルプレート中で二次スクリーニングからの結果は、プレート上の正しい複製されたコロニーを一致させることができるように、正しい向きで寒天プレートにラベルを付けます。 15〜18時間、37℃で成長し、その後、必要になるまで4℃で保存します。 ELISA二次スクリーニングを行います。 1×PBS中のドライミルク（w / v）の2％にすることによってブロッキング溶液を準備します。 ELISAプレートからのコーティング液を空にします。各ウェルにブロッキング溶液100μlを加えます。 4℃で少なくとも2時間、またはブロックO / NをRTでインキュベートします。 1×PBS中の0.05％の最終濃度にポリソルベート20を添加することにより、洗浄バッファーを準備します。 ELISAプレート当たり250ミリリットルを加えます。 20μlのを追加します。丸底培養プレートの各ウェルに細胞溶解界面活性剤を濃縮し、15〜20分間、室温でマイクロプレートシェーカー上で培養プレートをインキュベートします。溶解および洗浄工程5.5.4を同時に行うことができるようにELISAプレートのブロッキングが完了すると同時に溶解を始めます。 ELISAプレートからブロッキング溶液を空にします。 1回の洗浄につきウェル当たり洗浄緩衝液200μlでブロックしたELISAプレートを4回洗浄します。ウェルから洗浄バッファーを空にします。 各ウェルについて新しいチップを使用して、ELISAプレートの対応するウェルに細胞溶解プレートの各ウェルからの転送を50μl。 1〜2時間、室温でELISAプレートをインキュベートします。 バインドされたscFvを検出するために、抗体溶液を準備します。 西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）は、ライブラリのscFvに融合したFLAGエピトープタグに結合する一次抗体を抱合使用。 ELISA（参照サプライヤー＆＃で使用するために適切な希釈に抗体を希釈39; 1×PBS中の0.05％ポリソルベート20で2％での推奨）（w / v）のドライミルク。各プレートのための5ミリリットルを準備します。 ステップ5.5.4で説明したようにELISAプレートを洗浄緩衝液で4回洗浄します。 ELISAプレートの各ウェルに、抗体溶液50μlを加えます。室温で1〜2時間インキュベートします。 光を避けながら、製造業者のプロトコルごとに蒸留H 2 O中のOフェニレンジアミン二塩酸塩（OPD）錠を溶解することにより、HRP基質を準備します。 ELISAプレート当たり20ミリリットルを準備します。 必要に応じて蒸留H 2 Oで濃H 2 SO 4を希釈することによって3 MH 2 SO 4を準備します。 ELISAプレートあたり5ミリリットルを準備します。 注意：H 2 SO 4を強い酸です。適切な個人保護具を着用してください。 ステップ5.5.4で説明したように、洗浄緩衝液でELISAプレートを4回洗浄します。 HRPのsubstraでELISAプレートをインキュベートTE。 各ウェルにHRP基質200μlのを追加します。 、露光を最小限に一度に一つのELISAプレートに基板を追加し、次のプレートに進む前に、アルミホイルでラップします。暗所で室温で30〜60分間、プレートをインキュベートします。 最初の30分後、基板の黒ずみのためにプレートをチェックし、必要に応じて色を開発して可視化するために長くインキュベートします。 反応をクエンチするために各ウェルに3 MH 2 SO 4の50μlのを追加します。優しく泡立てずに上下にピペッティングすることにより、ウェル中の溶液を混ぜて、各ウェルに異なるチップを用いて。一貫性を保つためと飽和を防ぐために、各プレートのための溶液とを混合する前に、ELISAプレートのすべてにSO 4迅速かつ慎重にH 2を追加します。 プレートリーダーを用いて492nmで各プレートのウェル内の溶液の吸光度を測定します。 scFvはそのexhibバリアント識別するために、吸光度データを分析それが結合シグナルを約束し、これらの有望なscFvを特徴づけます。各プレートの平均信号よりもバックグラウンドシグナルよりも高く、高い吸光度信号を示すscFvを選択します。 注：吸光度レベルは、スクリーニングにおいて単離されたのscFv変異体の強さと一緒に、使用される抗原と抗FLAG抗体の特性に依存します。