We provide a method to simultaneously screen a library of antibody fragments for binding affinity and cytoplasmic solubility by using the Escherichia coli twin-arginine translocation pathway, which has an inherent quality control mechanism for intracellular protein folding, to display the antibody fragments on the inner membrane.
Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in the cytoplasm. Commonly used methods for the display and screening of recombinant antibody libraries do not incorporate intracellular protein folding quality control, and, thus, the antigen-binding capability and cytoplasmic folding and solubility of antibodies engineered using these methods often must be engineered separately. Here, we describe a protocol to screen a recombinant library of single-chain variable fragment (scFv) antibodies for antigen-binding and proper cytoplasmic folding simultaneously. The method harnesses the intrinsic intracellular folding quality control mechanism of the Escherichia coli twin-arginine translocation (Tat) pathway to display an scFv library on the E. coli inner membrane. The Tat pathway ensures that only soluble, well-folded proteins are transported out of the cytoplasm and displayed on the inner membrane, thereby eliminating poorly folded scFvs prior to interrogation for antigen-binding. Following removal of the outer membrane, the scFvs displayed on the inner membrane are panned against a target antigen immobilized on magnetic beads to isolate scFvs that bind to the target antigen. An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)-based secondary screen is used to identify the most promising scFvs for additional characterization. Antigen-binding and cytoplasmic solubility can be improved with subsequent rounds of mutagenesis and screening to engineer antibodies with high affinity and high cytoplasmic solubility for intracellular applications.
Anticorpi in grado di piegare e funzionante nell'ambiente intracellulare sono strumenti promettenti sia per la ricerca e applicazioni terapeutiche. Essi hanno la capacità di modulare l'attività della proteina legandosi a una proteina bersaglio all'interno delle cellule per evitare interazioni proteina-proteina, interrompere le interazioni degli acidi nucleici proteine, o impedire l'accesso substrato enzimi 1-5.
Sebbene gli anticorpi hanno molto potenziale per applicazioni intracellulari, li ingegneria per il corretto ripiegamento e solubilità in ambiente intracellulare pur mantenendo la capacità di legarsi ad un antigene bersaglio è impegnativo. L'ambiente citoplasmatico riducendo previene la formazione di legami disolfuro normalmente richiesti per la piegatura stabile di anticorpi integrali e frammenti anticorpali, incluse catena singola frammento variabile (scFv) anticorpi 6,7. Un certo numero di approcci evoluzione diretta sono stati impiegati per progettare anticorpi con haffinità IGH per bersaglio antigeni 8-10. Questi approcci usano comunemente phage display, visualizzazione della superficie del lievito, o la visualizzazione della superficie batterica per schermare grandi librerie di anticorpi 11-13. Questi metodi sono potenti ed efficaci per identificare gli anticorpi che si legano a bersagli, ma dipendono dalla via secretoria per trasportare proteine che verranno visualizzati 14-16. La via secretoria trasloca proteine ripiegate dal citoplasma riducendo nel lume reticolo endoplasmatico nel lievito o in periplasma nei batteri. Le proteine si ripiegano quindi in condizioni ossidanti e vengono visualizzati sulla superficie delle cellule o confezionati in particelle dei fagi per lo screening per l'affinità di legame 17,18. Come risultato, gli anticorpi isolati utilizzando queste tecniche non necessariamente piegare bene nel citoplasma, e la solubilità intracellulare spesso devono essere progettati separatamente, se verranno utilizzati gli anticorpi in applicazioni intracellulari.
Migliorarel'efficienza di anticorpi ingegneria che sono ben piegati nel citoplasma, abbiamo precedentemente riportato il successo di MAD-TRAP (display membrana ancorata riconoscimento Tat di proteine che associano), un metodo per lo screening di una libreria di anticorpi scFv usando Escherichia coli inner- Display a membrana 19. Batterica visualizzazione interna membrana si basa sul percorso twin-arginina traslocazione (Tat) per il trasporto di anticorpi esposta, a differenza di altri metodi di visualizzazione comune che utilizzano la via secretoria. Il percorso Tat contiene un meccanismo di controllo della qualità che consente solo solubili, proteine ripiegate in modo corretto per essere trasportate dal E. citoplasma coli, attraverso la membrana interna, e nel periplasma 20,21. Substrati overexpressed Tat (es., Proteine mirati al percorso Tat con una fusione N-terminale al segnale Tat peptide ssTorA) che sono ben piegati nel citoplasma formano una lunga durata traslocazione intermedio con l'N-terminale in citoplasma e il C-terminale in periplasma 19. Questo consente la visualizzazione di substrati Tat correttamente ripiegate, inclusi frammenti di anticorpi, sulla faccia periplasmic della E. coli membrana interna. Dopo aver rimosso la membrana esterna mediante digestione enzimatica per generare sferoplasti, anticorpi sono esposti allo spazio extracellulare (Figura 1). Questo permette di substrati Tat visualizzati sulla membrana interna per essere sottoposti a screening per il legame ad un target specifico. È importante sottolineare che, sfruttando il percorso Tat per la visualizzazione della superficie cellulare assicura che solo gli anticorpi nella libreria che sono ben piegati nel citoplasma saranno interrogati per la rilegatura, permettendo di ingegneria simultanea di affinità e piegatura intracellulare vincolante. In questo protocollo, si descrive come visualizzare una libreria scFv in E. coli membrana interna, pan biblioteca contro un antigene bersaglio, ed eseguire uno schermo secondario per identificare i costituenti più promettenti della biblioteca. Mentre ci concentriamo il protocollo sul scFv, il metodo potrebbe essere applicato a ingegneria proteina la cui applicazione richiede pieghevole vincolante e intracellulare.
Figura 1. Display interno-membrana Tat. In E. coli, anticorpi scFv che sono espressi come una fusione alla sequenza segnale ssTorA e correttamente ripiegate nel citoplasma vengono trasportati attraverso la membrana interna. Una traslocazione forme intermedie, dove i scFv sono ancorati nella membrana interna con l'N-terminale nel citoplasma e il C-terminale in periplasma. Il E. membrana esterna coli è enzimaticamente digerito per formare sferoplasti, esponendo così gli anticorpi ancorati allo spazio extracellulare e renderli disponibili per il rilevamento utilizzando un anticorpo che si lega al tag epitopo C-terminale fuso sul anticorpi visualizzato.carico / 54583 / 54583fig1large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Ingegneria anticorpi per l'attività citoplasmatica è un compito difficile a causa l'ambiente riducente del citoplasma, che impedisce la formazione di legami disolfuro stabilizzante 6,7. Questo fa sì che la maggior parte degli anticorpi di essere cytoplasmically inattiva meno che non siano progettati per la stabilità e la solubilità nel citoplasma, oltre ad essere progettato per affinità di legame. I metodi esistenti di phage display, visualizzazione di superficie batterica, e metodi di visualizzazione superficiali lievito utilizzare tutti la via secretoria 14-16 per la visualizzazione di anticorpi ingegnerizzati, ma questi metodi non hanno mezzi per progettare piegatura intracellulare. Anticorpi ingegnerizzati utilizzando visualizzazione interna membrana hanno migliorato la stabilità citoplasmatica e la solubilità in quanto il controllo di qualità di piegatura del percorso Tat impedisce traslocazione di anticorpi che sono mal ripiegate e instabili nel citoplasma. Questo metodo semplifica il processo iterativo di anticorpi intracellulari engineering per affinità unnd solubilità, come i due sono costruiti in un unico passaggio. Anche se questo metodo è stato progettato per ingegneria anticorpi con solubilità in ambiente intracellulare riduzione, può essere applicato anche ad anticorpi ingegneria di funzionare in condizioni non riducenti, poiché le proteine progettati utilizzando questo metodo mantenere il loro ripiegamento nell'ambiente ossidante periplasma.
Sebbene questa tecnica semplifica il processo di ingegneria anticorpi con alta affinità e alta solubilità citoplasmatica, diverse limitazioni sono importanti da considerare quando si utilizza questo protocollo. Quando si analizzano i segnali ELISA schermo secondario da identificare promettenti scFv varianti, la soglia per discernere tra le varianti potenzialmente interessanti e quelli che non possono esibire adeguata antigene vincolante non è probabile che sia evidente solo dopo parecchi cloni sono stati ulteriormente caratterizzati. E 'importante cercare migliorata legame sopra l'anticorpo genitore; però,un segnale anormalmente elevato potrebbe essere indicativo di avidità 29 o effetti di aggregazione 30, una sfida che non riguardano solo l'approccio di screening del display interno-membrana. Una limitazione chiave da ricordare quando si utilizza questo protocollo è l'incapacità di recuperare sferoplasti dopo panning, in quanto sono non vitali (dati non pubblicati). Ciò richiede le fasi di amplificazione del DNA e trasformazione di recuperare i plasmidi codificanti anticorpi.
Parecchi punti critici del protocollo consentono dell'ingegneria simultanea di piegatura e legame di anticorpi. Per lo screening per avere successo, la libreria di scFv viene proiettato deve essere espressa come una fusione al segnale peptide ssTorA. Senza questa sequenza, gli anticorpi non saranno indirizzati al percorso Tat e quindi non saranno traslocati al periplasma 19. Inoltre, è imperativo che un epitopo C-terminale è fuso agli anticorpi per consentire il rilevamento degli anticorpi visualizzati nel bidonesaggi ding. Chiaramente, la E. coli ceppo utilizzato per esprimere i scFv deve avere anche la necessaria macchinari percorso Tat, ma questo è vero per la E. comunemente utilizzati ceppi coli.
Modifiche questo protocollo è possibile migliorare il suo potenziale di isolare anticorpi con le caratteristiche desiderate. Un passo panning sottrattiva può essere completata prima di panning contro l'antigene bersaglio per esaurire la biblioteca scFv dei costituenti non desiderato. I sferoplasti biblioteca possono essere incubate con perline magnetiche rivestite con BCCP da solo o rivestita con una proteina non desiderato, ei sferoplasti che si legano a quelle sfere possono essere eliminati prima dello screening i restanti sferoplasti non legati per il legame con il target desiderato. Come indicato nelle Risultati rappresentativi, un metodo per migliorare l'affinità di un isolato scFv è quello di includere un concorrente solubili nella reazione panning di competere con gli scFv visualizzati sulle sferoplasti. Perché il comp solubileetitor è una proteina purificata, nessun DNA viene amplificato da esso, in modo che solo le sequenze di scFv esposti sulle sferoplasti saranno recuperati nella reazione PCR. Inoltre, questo metodo potrebbe essere estesa ad altri tipi di ingegneria anticorpi o alla non-anticorpi proteine leganti.
E. coli Display interno-membrana è una potente piattaforma per gli anticorpi di ingegneria con alta affinità e alti livelli di solubilità intracellulare. Questo metodo è particolarmente adatto per engineering efficiente di anticorpi progettati per funzionare in ambiente intracellulare. Questi anticorpi intracellulari sono già in fase di studio come potenziali terapie in una serie di settori, tra cui le malattie neurodegenerative, cancro e infezioni virali 31. Questa tecnica permetterà un uso più diffuso di anticorpi intracellulari come strumenti per la ricerca e la medicina in questi campi e qualsiasi altro campo in cui lo studio di una proteina bersaglio in situ è desiderato.
The authors have nothing to disclose.
We thank Tomer Zohar for work on scFv screening and characterization assays. A portion of this work was supported by award number F32CA150622 from the National Cancer Institute (to AJK). The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Cancer Institute or the National Institutes of Health.
scFv library | Varies | N/A | A suitable scFv library should be obtained from a commercial or academic source. |
MC4100 E. coli cells | Coli Genetic Stock Center | 6152 | Cells need to be chemically competent or electrocompetent, depending on the selected transformation method. |
Glycerol | Fisher Scientific | BP229-4 | |
Difco dehydrated culture media LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | BD | 244610 | |
Chloramphenicol (Cm) | Fisher Scientific | BP904-100 | |
Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358-1 | |
Potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366-500 | |
Sodium phosphate, dibasic (Na2HPO4) | Fisher Scientific | BP332-500 | |
Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | BP362-500 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9706-100 | |
Sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
Tris base | Fisher Scientific | BP1521 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 0.5 M | Fisher Scientific | BP2482-500 | |
Magnesium chloride (MgCl2) | Fisher Scientific | BP214-500 | |
Lysozyme | Sigma Aldrich | L3790-10X1ML | |
Vortex mixer | VWR | 97043-564 | |
Bicine | Fisher Scientific | BP2646100 | |
D-Biotin | Fisher Scientific | BP232-1 | |
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Fisher Scientific | BP1755-1 | |
BugBuster Master Mix (cell lysis detergent) | EMD Millipore | 71456 | |
Vivaspin 2 MWCO, 3000 daltons | GE Healthcare Sciences | 28932240 | |
Target antigen | Varies | N/A | Purified target antigen may be purchased or produced/purified. |
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 | Invitrogen | 65601 | |
Dynamag-2 magnet | Invitrogen | 12321D | |
Tube rotator | VWR | 13916-822 | |
PCR primers | IDT | N/A | Primer sequences are as described in the protocol. |
10X T4 DNA ligase reaction buffer | New England BioLabs | B0202S | |
T4 Polynucelotide kinase (PNK) | New England BioLabs | M0201S | Make sure the T4 ligase buffer used in the primer phosphorylation reaction contains 1 mM ATP. |
5X Phusion HF buffer pack | New England BioLabs | B0518S | |
Deoxynucleotide (dNTP) solution mix, 10 mM each dNTP | New England BioLabs | N0447L | |
Phusion DNA polymerase | New England BioLabs | M0530S | Other high-fidelity polymerases may be used as an alternative, but the annealing temperature in Table 3 must be adjusted. |
C1000 Touch thermal cycler with dual 48/48 fast reaction module | Bio-Rad | 185-1148 | |
Agarose | Promega | V3121 | |
SYBR Safe DNA gel stain | Invitrogen | S33102 | |
Wizard SV gel and PCR clean-up system | Promega | A9281 | |
T4 DNA ligase | New England BioLabs | M0202S | |
Microdialysis membrane filter | EMD Millipore | VSWP04700 | |
Agar | BD | 214030 | |
96-well polystyrene round-bottom cell culture plates | VWR | 10062-902 | |
Costar general polystyrene assay plate lids | Corning | 3931 | |
Microtitre plate shaker | VWR | 12620-926 | |
Costar 96 well EIA/RIA Easy Wash clear flat bottom polystyrene high bind microplate | Corning | 3369 | |
Bel-blotter polycarbonate 96-well replicating tool | Bel-Art Products | 378760002 | |
Instant nonfat dry milk | Quality Biological | A614-1000 | |
Tween 20 (polysorbate 20) | Fisher Scientific | BP337-500 | |
PopCulture reagent (concentrated cell lysis detergent) | EMD Millipore | 71092-3 | |
Monoclonal ANTI-FLAG M2-Peroxidase(HRP) antibody produced in mouse | Sigma Aldrich | A8592 | |
SigmaFast OPD | Sigma Aldrich | P9187-50SET | |
Sulfuric acid (H2SO4), 10N solution | Fisher Scientific | SA200-1 | |
Reynolds Wrap aluminum foil | VWR | 89079-075 | |
BioTek Epoch microplate spectrophotometer | Fisher Scientific | 11120570 |