العرض الداخلية غشاء البكتيريا لفحص مكتبة من الأجسام المضادة شظايا
Summary
We provide a method to simultaneously screen a library of antibody fragments for binding affinity and cytoplasmic solubility by using the Escherichia coli twin-arginine translocation pathway, which has an inherent quality control mechanism for intracellular protein folding, to display the antibody fragments on the inner membrane.
Abstract
Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in the cytoplasm. Commonly used methods for the display and screening of recombinant antibody libraries do not incorporate intracellular protein folding quality control, and, thus, the antigen-binding capability and cytoplasmic folding and solubility of antibodies engineered using these methods often must be engineered separately. Here, we describe a protocol to screen a recombinant library of single-chain variable fragment (scFv) antibodies for antigen-binding and proper cytoplasmic folding simultaneously. The method harnesses the intrinsic intracellular folding quality control mechanism of the Escherichia coli twin-arginine translocation (Tat) pathway to display an scFv library on the E. coli inner membrane. The Tat pathway ensures that only soluble, well-folded proteins are transported out of the cytoplasm and displayed on the inner membrane, thereby eliminating poorly folded scFvs prior to interrogation for antigen-binding. Following removal of the outer membrane, the scFvs displayed on the inner membrane are panned against a target antigen immobilized on magnetic beads to isolate scFvs that bind to the target antigen. An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)-based secondary screen is used to identify the most promising scFvs for additional characterization. Antigen-binding and cytoplasmic solubility can be improved with subsequent rounds of mutagenesis and screening to engineer antibodies with high affinity and high cytoplasmic solubility for intracellular applications.
Introduction
أجسام مضادة قادرة على لطي وتعمل في بيئة الخلايا هي أدوات واعدة لكل من البحوث والتطبيقات العلاجية. لديهم القدرة على تعديل نشاط البروتين ملزمة لبروتين هدف داخل الخلايا لمنع تفاعلات البروتين البروتين، وتعطيل التفاعلات حمض البروتين النووي، أو منع الوصول إلى الركيزة الانزيمات 1-5.
على الرغم من أن الأجسام المضادة لديهم الكثير من الإمكانيات لتطبيقات الخلايا، هندسة منهم للطي السليم والذوبان في البيئة داخل الخلايا مع الحفاظ على القدرة على ربط لمستضد الهدف هو الصعبة. البيئة هيولي خفض يمنع تشكيل السندات ثاني كبريتيد المطلوبة عادة للطي استقرارا من الأجسام المضادة كامل طول وشظايا الأجسام المضادة، بما في ذلك سلسلة واحدة جزء متغير (scFv) الأجسام المضادة 6،7. وقد تم استخدام عدد من نهج التطور الموجه لهندسة الأجسام المضادة مع حالانتماءات IGH للهدف مستضدات 8-10. هذه الأساليب شيوعا في استخدام عرض فج، الخميرة عرض السطح، أو عرض سطح البكتيريا للكشف مكتبات كبيرة من الأجسام المضادة 11-13. وهذه الأساليب هي قوية وفعالة لتحديد الأجسام المضادة التي ترتبط الأهداف، ولكنها تعتمد على مسار إفرازية لنقل البروتينات التي سيتم عرضها 14-16. مسار إفرازية translocates البروتينات المطوية من السيتوبلازم الحد في تجويف الشبكة الإندوبلازمية في الخميرة أو في الجبلة المحيطية في البكتيريا. ثم طي البروتينات في ظل ظروف المؤكسدة ويتم عرض على سطح الخلية أو تعبئتها الى جزيئات فج للكشف عن تقارب 17،18 ملزمة. ونتيجة لذلك، فإن الأجسام المضادة المعزولة باستخدام هذه التقنيات لا أضعاف بالضرورة كذلك في السيتوبلازم، ويجب أن تكون في كثير من الأحيان هندسة الذوبان داخل الخلايا بشكل منفصل إذا كان سيتم استخدام الأجسام المضادة في التطبيقات داخل الخلايا.
لتحسينفعالية الأجسام المضادة الهندسية التي هي مطوية بشكل جيد في السيتوبلازم، ونحن ذكرت في وقت سابق نجاح MAD-TRAP (عرض الراسية غشاء للاعتراف أساس تات من البروتينات ربط)، وهي طريقة لفحص مكتبة الأجسام المضادة scFv باستخدام كولاي inner- عرض غشاء 19. البكتيرية عرض الداخلي غشاء يعتمد على المسار المزدوج أرجينين النبات (تات) لنقل الأجسام المضادة عرض، على النقيض من طرق العرض المشترك الأخرى التي تستخدم مسار إفرازية. يحتوي على مسار تات آلية لمراقبة الجودة التي تسمح فقط للذوبان والبروتينات مطوية بشكل صحيح ليتم نقلها من E. السيتوبلازم القولونية، عبر الغشاء الداخلي، وفي الجبلة المحيطية 20،21. ركائز Overexpressed تات (أي والبروتينات التي تستهدف مسار تات مع الانصهار N-محطة لالببتيد إشارة تات ssTorA) التي يتم طيها بشكل جيد في السيتوبلازم تشكل النبات طويل الأجل المتوسط مع N-محطة طن السيتوبلازم ومحطة سي في الجبلة المحيطية 19. وهذا يسمح عرض من ركائز تات مطوية بشكل صحيح، بما في ذلك أجزاء الأجسام المضادة، على وجه محيط بالجبلة من E. الغشاء الداخلي القولونية. بعد إزالة الغشاء الخارجي عن طريق الهضم الأنزيمي لتوليد spheroplasts، تتعرض الأجسام المضادة إلى الفضاء خارج الخلية (الشكل 1). وهذا يسمح ركائز تات للظهور في الغشاء الداخلي ليتم فرزهم للربط إلى هدف محدد. الأهم من ذلك، تسخير مسار تات للعرض على سطح الخلية يضمن فقط الأجسام المضادة في المكتبة التي هي مطوية بشكل جيد في السيتوبلازم سيتم التحقيق معهم لمدة ملزمة، مما يسمح الهندسة المتزامنة لتقارب وقابلة للطي داخل الخلايا ملزمة. في هذا البروتوكول، ونحن تصف كيفية عرض مكتبة scFv على E. الغشاء الداخلي القولونية، عموم مكتبة ضد المستضد الهدف، وأداء الشاشة الثانوية للتعرف على المقومات الواعدة في المكتبة. بينما نحن نركز البروتوكول الخاص scFvs، يمكن تطبيق الطريقة لهندسة أي البروتين الذي يتطلب للطي ملزمة والخلايا التطبيق.
الشكل 1. تات عرض الداخلي غشاء. وفي E. القولونية، ويتم نقل الأجسام المضادة scFv التي يتم التعبير عنها كما انصهار لتسلسل إشارة ssTorA ومطوية في السيتوبلازم بشكل صحيح عبر الغشاء الداخلي. والنبات الأشكال الوسيطة، حيث ترتكز على scFvs في الغشاء الداخلي مع N-محطة في السيتوبلازم ومحطة سي في الجبلة المحيطية. وE. يتم هضم الغشاء الخارجي القولونية إنزيمي لتشكيل spheroplasts، وبالتالي تعريض الأجسام المضادة الراسية في الفضاء خارج الخلية وإتاحتها للكشف باستخدام الأجسام المضادة التي تربط إلى C-عضال العلامة حاتمة تنصهر على الضد المعروض.تحميل / 54583 / 54583fig1large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Protocol
Representative Results
Discussion
هندسة الأجسام المضادة للنشاط حشوية مهمة صعبة نظرا للبيئة والحد من السيتوبلازم، مما يعوق تشكيل استقرار السندات كبريتيد 6،7. هذا يسبب الكثير من الأجسام المضادة ليكون غير نشط cytoplasmically إلا إذا صممت أنهم من أجل الاستقرار والقابلية للذوبان في السيتوبلازم، بالإضافة إلى كونها هندسيا لتقارب ملزمة. الأساليب الحالية لعرض فج، وعرض سطح البكتيرية، وطرق عرض الخميرة سطح كل استخدام مسار إفرازية 14-16 لعرض الأجسام المضادة هندسيا، ولكن هذه الأساليب ليس لديهم وسيلة لهندسة قابلة للطي داخل الخلايا. وتحسنت الأجسام المضادة هندسيا باستخدام العرض الداخلي غشاء الاستقرار حشوية والذوبان لمراقبة الجودة للطي لمسار تات يمنع النبات من الأجسام المضادة التي يتم سيئة مطوية وغير مستقرة في السيتوبلازم. هذه الطريقة يبسط عملية تكرارية من الأجسام المضادة الهندسة داخل الخلايا لتقارب لالثانية الذوبان، كما صممت خاصيتين في خطوة واحدة. وعلى الرغم من تصميم هذه الطريقة لهندسة الأجسام المضادة مع الذوبان في البيئة داخل الخلايا الحد، فإنه يمكن أيضا أن تطبق على الأجسام المضادة الهندسة على العمل في ظروف غير الحد، لأن البروتينات هندسيا باستخدام هذه الطريقة تحافظ قابلة للطي في البيئة المؤكسدة من الجبلة المحيطية.
على الرغم من أن هذه التقنية يبسط عملية هندسة الأجسام المضادة مع قابلية عالية والذوبان هيولي عالية، العديد من القيود هامة يجب مراعاتها عند استخدام هذا البروتوكول. عند تحليل الإشارات شاشة ELISA الثانوية لتحديد واعدة scFv المتغيرات، عتبة تمييز بين متغيرات يحتمل أن تكون مثيرة للاهتمام وتلك التي قد لا تظهر كافية ملزمة مستضد ليس من المرجح أن تكون واضحة حتى بعد عدة استنساخ تم التعرف على أكثر من ذلك. من المهم أن نبحث عن تحسن ملزمة على الأجسام المضادة الأم. ومع ذلك،إشارة عالية بشكل غير طبيعي يمكن أن يكون مؤشرا على الطمع 29 أو آثار التجميع 30، وهو تحد ليست وحيدة النهج عرض الفحص الداخلي غشاء. وجود قيود الواجب تذكره عند استخدام هذا البروتوكول هو عدم القدرة على استعادة spheroplasts بعد بالغسل، لأنها غير قابلة للحياة (بيانات غير منشورة). وهذا يستدعي التضخيم الحمض النووي والتحول خطوات لاسترداد البلازميدات ترميز الأجسام المضادة.
العديد من الخطوات الهامة للبروتوكول تمكن الهندسة المتزامنة للطي وملزمة من الأجسام المضادة. لفحص لتكون ناجحة، يجب أن أعرب مكتبة scFv يجري فرزهم كما انصهار للإشارة الببتيد ssTorA. بدون هذا التسلسل، لن يتم توجيه الأجسام المضادة لمسار تات وبالتالي لن يكون translocated إلى الجبلة المحيطية 19. بالإضافة إلى ذلك، لا بد من أن علامة حاتمة C-محطة وتنصهر إلى الأجسام المضادة للسماح للكشف عن الأجسام المضادة المعروضة في بنالمقايسات دينغ. ومن الواضح أن E. كولاي سلالة تستخدم للتعبير يجب أن يكون لديك ما يلزم تات الآلات ممر لscFvs، ولكن هذا ينطبق على E. يشيع استخدامها سلالات القولونية.
تعديلات على هذا البروتوكول هي الممكنة لتحسين قدرتها على عزل الأجسام المضادة مع الخصائص المطلوبة. قد يتم الانتهاء خطوة بالغسل مطروح قبل بالغسل ضد المستضد الهدف في استنزاف المكتبة scFv من المكونات غير المرغوب. وspheroplasts مكتبة يمكن حضنت مع الخرز المغناطيسي المغلفة مع BCCP وحدها أو المغلفة مع بروتين غير المرغوبة، وspheroplasts التي تربط لتلك الخرزات يمكن التخلص منها قبل الفرز وspheroplasts غير منضم المتبقية للربط إلى الهدف المنشود. كما جاء في نتائج التمثيلية، وهي طريقة لتحسين تقارب من scFv معزولة لتشمل منافس للذوبان في رد فعل بالغسل للتنافس مع scFvs ظهور في spheroplasts. لأن شركات القابلة للذوبانetitor هو البروتين النقي، يتم تضخيمه أي الحمض النووي من ذلك، سيتم استردادها تسلسل ذلك فقط من scFvs ظهور في spheroplasts في رد فعل PCR. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يمتد هذا الأسلوب لهندسة أنواع أخرى من الأجسام المضادة أو البروتينات غير ملزم الأجسام المضادة.
كولاي عرض الداخلية غشاء هو منصة قوية لأجسام هندسية مع قابلية عالية ومستويات عالية من الذوبان داخل الخلايا. هذا الأسلوب هو مناسبة خاصة للهندسة فعالة من الأجسام المضادة مصممة للعمل في البيئة داخل الخلايا. ويجري بالفعل استكشاف هذه الأجسام المضادة الخلايا كما العلاجات المحتملة في عدد من المجالات، بما في ذلك أمراض الاعصاب والسرطان والالتهابات الفيروسية 31. هذه التقنية سوف تتيح استخدام أكثر انتشارا من الأجسام المضادة الخلايا كأدوات للبحث والطب في هذه المجالات وفي أي ميدان آخر حيث الدراسة والتعلم هو المطلوب الهدف البروتين في الموقع.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Tomer Zohar for work on scFv screening and characterization assays. A portion of this work was supported by award number F32CA150622 from the National Cancer Institute (to AJK). The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Cancer Institute or the National Institutes of Health.
Materials
| scFv library | Varies | N/A | A suitable scFv library should be obtained from a commercial or academic source. |
| MC4100 E. coli cells | Coli Genetic Stock Center | 6152 | Cells need to be chemically competent or electrocompetent, depending on the selected transformation method. |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-4 | |
| Difco dehydrated culture media LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | BD | 244610 | |
| Chloramphenicol (Cm) | Fisher Scientific | BP904-100 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Sodium phosphate, dibasic (Na2HPO4) | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | BP362-500 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9706-100 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP1521 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 0.5 M | Fisher Scientific | BP2482-500 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Lysozyme | Sigma Aldrich | L3790-10X1ML | |
| Vortex mixer | VWR | 97043-564 | |
| Bicine | Fisher Scientific | BP2646100 | |
| D-Biotin | Fisher Scientific | BP232-1 | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Fisher Scientific | BP1755-1 | |
| BugBuster Master Mix (cell lysis detergent) | EMD Millipore | 71456 | |
| Vivaspin 2 MWCO, 3000 daltons | GE Healthcare Sciences | 28932240 | |
| Target antigen | Varies | N/A | Purified target antigen may be purchased or produced/purified. |
| Dynabeads MyOne Streptavidin T1 | Invitrogen | 65601 | |
| Dynamag-2 magnet | Invitrogen | 12321D | |
| Tube rotator | VWR | 13916-822 | |
| PCR primers | IDT | N/A | Primer sequences are as described in the protocol. |
| 10X T4 DNA ligase reaction buffer | New England BioLabs | B0202S | |
| T4 Polynucelotide kinase (PNK) | New England BioLabs | M0201S | Make sure the T4 ligase buffer used in the primer phosphorylation reaction contains 1 mM ATP. |
| 5X Phusion HF buffer pack | New England BioLabs | B0518S | |
| Deoxynucleotide (dNTP) solution mix, 10 mM each dNTP | New England BioLabs | N0447L | |
| Phusion DNA polymerase | New England BioLabs | M0530S | Other high-fidelity polymerases may be used as an alternative, but the annealing temperature in Table 3 must be adjusted. |
| C1000 Touch thermal cycler with dual 48/48 fast reaction module | Bio-Rad | 185-1148 | |
| Agarose | Promega | V3121 | |
| SYBR Safe DNA gel stain | Invitrogen | S33102 | |
| Wizard SV gel and PCR clean-up system | Promega | A9281 | |
| T4 DNA ligase | New England BioLabs | M0202S | |
| Microdialysis membrane filter | EMD Millipore | VSWP04700 | |
| Agar | BD | 214030 | |
| 96-well polystyrene round-bottom cell culture plates | VWR | 10062-902 | |
| Costar general polystyrene assay plate lids | Corning | 3931 | |
| Microtitre plate shaker | VWR | 12620-926 | |
| Costar 96 well EIA/RIA Easy Wash clear flat bottom polystyrene high bind microplate | Corning | 3369 | |
| Bel-blotter polycarbonate 96-well replicating tool | Bel-Art Products | 378760002 | |
| Instant nonfat dry milk | Quality Biological | A614-1000 | |
| Tween 20 (polysorbate 20) | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| PopCulture reagent (concentrated cell lysis detergent) | EMD Millipore | 71092-3 | |
| Monoclonal ANTI-FLAG M2-Peroxidase(HRP) antibody produced in mouse | Sigma Aldrich | A8592 | |
| SigmaFast OPD | Sigma Aldrich | P9187-50SET | |
| Sulfuric acid (H2SO4), 10N solution | Fisher Scientific | SA200-1 | |
| Reynolds Wrap aluminum foil | VWR | 89079-075 | |
| BioTek Epoch microplate spectrophotometer | Fisher Scientific | 11120570 |
References
- Biocca, S., Pierandrei-Amaldi, P., Campioni, N., Cattaneo, A. Intracellular immunization with cytosolic recombinant antibodies. Biotechnology (NY). 12 (4), 396-399 (1994).
- Chen, S. Y., Bagley, J., Marasco, W. A. Intracellular antibodies as a new class of therapeutic molecules for gene-therapy. Hum. Gene Ther. 5 (5), 595-601 (2008).
- Gargano, N., Biocca, S., Bradbury, A., Cattaneo, A. Human recombinant antibody fragments neutralizing human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase provide an experimental basis for the structural classification of the DNA polymerase family. J Virol. 70 (11), 7706-7712 (1996).
- Mhashilkar, A. M., et al. Inhibition of HIV-1 Tat-mediated LTR transactivation and HIV-1 infection by anti-Tat single chain intrabodies. Embo J. 14 (7), 1542-1551 (1995).
- Strube, R. W., Chen, S. Y. Characterization of anti-cyclin E single-chain Fv antibodies and intrabodies in breast cancer cells: enhanced intracellular stability of novel sFv-F-c intrabodies. J. Immunol. Meth. 263 (1-2), 149-197 (2002).
- Mössner, E., Koch, H., Plückthun, A. Fast selection of antibodies without antigen purification: adaptation of the protein fragment complementation assay to select antigen-antibody pairs. J. Mol. Biol. 308 (2), 115-122 (2001).
- Wörn, A., et al. Correlation between in vitro stability and in vivo performance of anti-GCN4 intrabodies as cytoplasmic inhibitors. J Biol Chem. 275 (4), 2795-2803 (2000).
- Knappik, A., Plückthun, A. Engineered turns of a recombinant antibody improve its in vivo folding. Protein Eng. 8 (1), 81-89 (1995).
- Martineau, P., Jones, P., Winter, G. Expression of an antibody fragment at high levels in the bacterial cytoplasm. J Mol Biol. 280 (1), 117-127 (1998).
- Steipe, B., Schiller, B., Plückthun, A., Steinbacher, S. Sequence statistics reliably predict stabilizing mutations in a protein domain. J. Mol. Biol. 240 (3), 188-192 (1994).
- Daugherty, P. S. Protein engineering with bacterial display. Curr Opin Struct Biol. 17 (4), 474-480 (2007).
- Lener, M., et al. Diverting a protein from its cellular location by intracellular antibodies. Eur. J. Biochem. 267 (4), 1196-1205 (2000).
- Lynch, S. M., Zhou, C., Messer, A. An scFv intrabody against the nonamyloid component of α-synuclein reduces intracellular aggregation and toxicity. J. Mol. Biol. 377 (1), 136-147 (2008).
- Gai, S. A., Wittrup, K. D. Yeast surface display for protein engineering and characterization. Curr. Opin. Struc. Biol. 17 (4), 467-473 (2007).
- Kieke, M. C., et al. Selection of functional T cell receptor mutants from a yeast surface-display library. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96 (10), 5651-5656 (1999).
- Steiner, D., Forrer, P., Stumpp, M. T., Pluckthun, A. Signal sequences directing cotranslational translocation expand the range of proteins amenable to phage display. Nat. Biotechnol. 24, 823-831 (2006).
- Pugsley, A. P. The complete general secretory pathway in gram-negative bacteria. Microbiol. Rev. 57 (1), 50-108 (1993).
- Rapoza, M. P., Webster, R. E. The filamentous bacteriophage assembly proteins require the bacterial SecA protein for correct localization to the membrane. J. Bacteriol. 175 (6), 1856-1859 (1993).
- Karlsson, A. J., et al. Engineering antibody fitness and function using membrane-anchored display of correctly folded proteins. J. Molec. Biol. 416 (1), 94-107 (2012).
- DeLisa, M. P., Tullman, D., Georgiou, G. Folding quality control in the export of proteins by the bacterial twin-arginine translocation pathway. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (10), 6115-6120 (2003).
- Fisher, A. C., Kim, W., DeLisa, M. P. Genetic selection for protein solubility enabled by the folding quality control feature of the twin-arginine translocation pathway. Protein Sci. 15 (3), 449-458 (2006).
- Maynard, J., Georgiou, G. Antibody engineering. Annu Rev Biomed Eng. 2, 339-376 (2000).
- Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1, (2012).
- Milo, R., Jorgensen, P., Moran, U., Weber, G., Springer, M. BioNumbers–the database of key numbers in molecular and cell biology. Nucleic Acids Res. 38, D750-D753 (2010).
- Hermanson, G. T. . Bioconjugate Techniques. , (2013).
- Tayapiwatana, C., Chotpadiwetkul, R., Kasinrerk, W. A novel approach using streptavidin magnetic bead-sorted in vivo biotinylated survivin for monoclonal antibody production. J Immunol Methods. 317 (1-2), 1-11 (2006).
- Zhu, G., Song, L., Lippard, S. J. Visualizing inhibition of nucleosome mobility and transcription by cisplatin-DNA interstrand crosslinks in live mammalian cells. Cancer Res. 73 (14), 4451-4460 (2013).
- Bogsch, E. G., et al. An essential component of a novel bacterial protein export system with homologues in plastids and mitochondria. J. Biol. Chem. 273, 18003-18006 (1998).
- Julian, M. C., et al. Co-evolution of affinity and stability of grafted amyloid-motif domain antibodies. Protein Eng. Des. Sel. 28 (10), 339-350 (2015).
- Garber, K. Bispecific antibodies rise again. Nat. Rev. Drug. Discov. 13 (11), 799-801 (2014).
- Marschall, A. L., Dübel, S., Böldicke, T. Specific in vivo knockdown of protein function by intrabodies. MAbs. 7 (6), 1010-1035 (2015).
