Human peripheral blood is commonly used for the assessment of the humoral immune response. Here, the methods for isolating human B cells from peripheral blood, differentiating human B cells into antibody (Ab)-secreting B cells (ASCs) in culture, and enumerating the total IgM- and IgG-ASCs via an ELISpot assay are described.
A marca da imunidade humoral é gerar ASC funcionais, que sintetizam e segregam Abs específica para um antigénio (Ag), tal como um agente patogénico, e são usados para a defesa do hospedeiro. Para a determinação quantitativa do estado funcional da resposta imune humoral de um indivíduo, tanto Abs circulantes no soro e ASC são geralmente medidos como leituras funcionais. Nos seres humanos, o sangue periférico é a amostra mais conveniente e facilmente acessível e que pode ser utilizado para a determinação da resposta imune humoral induzida por células hospedeiras B. subconjuntos distintos de células B, incluindo ASC, podem ser isolados directamente a partir de sangue periférico por meio de selecção com micropérolas Ab-conjugados específicos de linhagem ou através de separação de células com citometria de fluxo. Além disso, as células B naive e de memória purificados podem ser activadas e diferenciadas em cultura em ASC. As actividades funcionais de ASC para contribuir para a secreção de Ab pode ser quantificada por ELISpot, que é um ensaio de enzima que convergeensaio -Conectado imunoabsorvência (ELISA) e tecnologias de transferência Western para permitir a enumeração de ASC individuais no nível de uma única célula. Na prática, o ensaio ELISpot tem sido cada vez mais utilizadas para avaliar a eficácia da vacina por causa da facilidade de manuseamento de um grande número de amostras de sangue. Os métodos de isolamento de células B humanas a partir de sangue periférico, a diferenciação de células B em ASC in vitro, e o emprego de ELISpot para a quantificação de um total de IgM e IgG-ASC serão descritos aqui.
As células B desempenham um papel central no desenvolvimento da imunidade humoral. Eles inicialmente se desenvolvem na medula óssea e entram na corrente sanguínea como células naive B, que podem migrar para os tecidos linfóides, tais como o baço, nódulos linfáticos, amígdalas, e para um maior desenvolvimento. Após a Ag encontro, algumas células B naïve migrar para folículos linfóides, onde as células de centro germinal B podem se diferenciar em células B de memória e plasmablasts (PBS) / células plasmáticas (PCs). Enquanto a maioria dos computadores PBS / egressos para a corrente sanguínea, alguns, eventualmente, residem na medula óssea a sofrer diferenciação terminal em PCs 1 de vida longa. As células B em circulação são heterogêneos, e no estado estacionário, PBS / PCs são raros no sangue periférico 2. Como resultado da disponibilidade de marcadores de superfície específicos da linhagem, citometria de fluxo tornou-se um método popular para a identificação e caracterização das subpopulações de células B no sangue periférico. Uma aplicação alargada dos cytometr fluxoy é a adição de uma função de separação de células, que permite a separação e isolamento de subconjuntos individuais de células B com elevada pureza. Com base na expressão de receptores de superfície específicos em diferentes fases de desenvolvimento, as células B circulantes humanos são geralmente classificados em três subpopulações principais: células B virgens (CD19 + CD27 – CD38 -), células B de memória (CD19 + CD27 + CD38 -), e PBS / PCS (CD19 + CD27 + CD38 +) 3-4 (Figura 1). células B virgens, por natureza, não encontrei Ags. No entanto, eles podem ser diferenciadas em células CD27 + IgM + B de memória. Embora as células B virgens são homogêneos em expressar receptor do antigénio das células B (BCR) moléculas -associated (por exemplo, CD19, CD20 e CD22) eles são heterogêneos em seu repertório imunoglobulina 5. A maioria das células CD27 + B de memória podem ser diferenciados em CD27+ / CD38 + oi PBS / PCs 6. Além disso, as células B de memória e PBS / PCs são policlonais e exibem desenvolvimento e funcionais heterogeneidade 4-7. PBS / PCs em circulação são normalmente de curta duração e não expressam CD138, mas aqueles feitos para se estabelecer na medula óssea irá terminal diferenciar e se tornar longa duração. Terminalmente PCs diferenciadas expressam CD138 e para baixo-regular moléculas CD27 em suas superfícies 8. Uma vez que tanto PBS e PCs são capazes de secretar Abs, em muitas ocasiões, eles são colectivamente denotado como ASC. Em contraste, nem as células B naive nem células B de memória pode produzir quantidades apreciáveis de Abs 9-10. No entanto, quando isolados, tanto em células B naive e de memória podem ser diferenciadas em ASC em 3 – 10 dias, quando colocado em condições de cultura adequadas 6, 11-15. Na verdade, ASC derivado in vitro compartilhar diferenciação expressões superficiais semelhantes de CD27 e CD38 com os fr diretamente isoladosangue periférico om 6. Além disso, as ASC diferenciadas in vitro expressam um baixo nível de superfície CD20, semelhante que circula de PBS / PCs 6. Embora as ASC derivado de cultura são todos de curta duração, podem secretar Abs, indicando que eles são funcionalmente competentes e capazes de contribuir para a imunidade humoral.
Ambos ELISA e ELISpot são, de longe, os métodos mais geralmente aplicado com o qual para obter informação funcional sobre a resposta imunológica humoral. ELISA é um ensaio baseado em placa de 96 poços, e é frequentemente utilizado para medir os títulos de soro Abs Ag-specific e outros analitos (por exemplo, citocinas). É conveniente e escalável. ELISA foi concebido para utilizar um ensaio de enzima de fase sólida para detectar a presença de ABS ou de outras substâncias, tais como soro, numa amostra de líquido 16. As leituras de ELISA no soro têm sido amplamente utilizados para representar a resposta imune do corpo. Uma ferramenta necessária para a aquisição de readouts de ensaios de ELISA é um leitor de microplacas espectrofotométrico. O leitor pode determinar a densidade óptica (DO) dos produtos finais normalmente resultantes da reacção de peroxidase de rábano (HRP) Abs detecção -conjugated e seus substratos específicos 17. No que diz respeito a informações sobre a resposta imunológica humoral, os níveis de soro AB determinado por ELISA representam a colectiva, mas não indivíduo, o desempenho de ASC no corpo. Em adição, a ELISA não tem em conta a participação de células B de memória, que não secretam Abs.
Tal como ELISA, ELISpot é um método amplamente utilizado para a detecção e monitorização da resposta imunitária em amostras de sangue periférico 17-18. ELISpot é uma técnica relacionada com um ELISA de tipo sanduíche. Nele, as células são colocadas dentro do difluoreto de polivinilideno (PVDF) poços apoiados por uma membrana de microplacas de 96 poços para uma cultura de curto prazo. O ensaio ELISpot é análoga à execução de uma transferência de Western em microplacas e developing as manchas na membrana de PVDF em cada poço. Um sistema de leitor de ELISpot automatizado ou um estereomicroscópio para contagem manual é necessária. A principal vantagem de ELISpot na detecção de uma resposta imunitária é a sua excelente sensibilidade na quantificação da ASC e células secretoras de citocinas. Ela reporta as suas actividades funcionais na imunidade humoral e celular, respectivamente. Na medição da função imune humoral, os níveis de soro AB determinado por ELISA e o número de ASC enumerados por ELISPOT são frequentemente correlacionados, mas as leituras de dados a partir destes dois ensaios têm algumas diferenças em implicações funcionais 19-20. A principal vantagem de ELISpot é a sua sensibilidade do método. O nível dos títulos de soro AB como relatado por ELISA apresenta-se semi-quantitativamente, como leituras de DO, que denota o nível de Ab relativa, ou mais quantitativamente, como leituras de concentração quando uma quantidade conhecida dos isotipos apropriados de Abs é incluída para referência. Em contraste, os resultados de ELISpot são Presented como o número absoluto de ASC em uma associação de células de interesse (por exemplo, células não fraccionadas mononucleares de sangue periférico (PBMC) e células B purificadas a partir de PBMCs). ELISpot pode detectar um único ASC, mas ELISA requer quantidades ab a partir da ASC para atingir concentrações dependente de ensaio optimizadas antes da medição. Assim, é obviamente superior ELISpot para ELISA na sensibilidade da quantificação. Além disso, também ELISpot é adequada para a quantificação dos ASC diferenciadas in vitro a partir de células B de memória activadas. células B de memória não secretam Abs, mas podem se diferenciar em ASC sobre a ativação; Eles, portanto, não tem nenhuma contribuição para Abs de soro detectados por ELISA. Assim, ELISpot é o método de escolha para a medição da resposta imune de células de memória B em circulação após a activação em cultura. Ele permite o acompanhamento da manutenção da imunidade humoral a longo prazo.
Isolamento e Purificação de Células de Sangue Periférico Humano B
Normalmente, os glóbulos vermelhos podem ser eficientemente rompido e afastada pelo tampão de lise (passo 1.2). É importante que não se incubar PBMCs com o tampão de lise dos glóbulos vermelhos mais do que 5 minutos, como a viabilidade das células pode ser afectada pelo cloreto de amónio. Alternativamente, os glóbulos vermelhos e as plaquetas podem ser removidos simultaneamente por o protocolo seguinte.
<p class=…The authors have nothing to disclose.
This study was supported by a research grant from the Ministry of Science and Technology of the Executive Yuan of Taiwan (NSC99-2320-B-002-011). I would like to acknowledge the excellent service provided by the Flow Cytometric Analyzing and Sorting Core of the First Core Laboratory in College of Medicine of National Taiwan University.
BD Vacutainer K2E | BD Biosciences | 367525 | 10 ml tube |
Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | endotoxin-free |
Trypan blue 0.5% solution | Biological Industries | 03-102-1B | |
IMag Human B lymphocyte enrichment set | BD Biosciences | 558007 | |
Biotinylated CD27 mAb | Biolegend | 302804 | clone O323 |
Streptavidin magnetic microbeads | BD Biosciences | 9000810 | |
15 ml Falcon tubes | BD Falcon | 352196 | |
Blue nylon mesh cell strainer, 40 μm | BD Falcon | 352340 | |
Anti-human CD19-APC | Biolegend | 302212 | clone HIB19 |
Anti-human CD27-eFluor 450 | eBioscience | 48-0279-42 | clone O323 |
Anti-human CD38-PE-Cy7 | Biolegend | 303516 | clone HIT2 |
Anti-human CD38-PE-Cy7 | BD Biosciences | 560677 | clone HIT2 |
Anti-human CD45-FITC | Biolegend | 304006 | clone HI30 |
Anti-human CD45-FITC | BD Biosciences | 555482 | clone HI30 |
Anti-mouse/rat/human CD27-PerCP Cy5.5 | Biolegend | 124213 | clone LG.3A10 |
Anti-human CD27-PerCP Cy5.5 | BD Biosciences | 65429 | clone L128 |
Anti-human CD19-FITC | Miltenyi Biotec | 130-098-064 | clone LT19 |
Anti-human CD19-FITC | GeneTex | GTX75599 | clone LT19 |
Anti-human CD20-FITC | BD Biosciences | 555622 | clone 2H7 |
biotinylated anti-human CD27 | Biolegend | 302804 | clone O323 |
biotinylated anti-human CD27 | eBioscience | 13-0279-80 | clone O323 |
7-aminoactinomycin D (7-AAD) | BD Biosciences | 559925 | |
CpG (ODN 2006) | InvivoGen | tlrl-2006 | type B CpG |
Recombinant human IL-2 | PeproTech | 200-02 | |
Recombinant human IL-10 | PeproTech | 200-10 | |
Recombinant human IL-21 | PeproTech | 200-21 | |
Recombinant human sCD40L | PeproTech | 310-02 | |
Protein A of S. aureus Cowan (SAC) | Sigma-Aldrich | 82526 | |
Pokeweed mitogen (PWM) | Sigma-Aldrich | L9379 | |
MultiScreen filter plates, 0.45 µm pore size | Merck Millipore | MSIPS4510 | sterile, clear 96-well filter plate with hydrophobic PVDF membrane |
BCIP/NBT solution | Sigma-Aldrich | B6404 | |
BCIP/NBT single reagent, alkaline phosphatase substrate | Merck Millipore | ES006 | |
Human IgG | Jackson ImmunoResearch | 009-000-003 | |
Human IgG, Fc fragment | Jackson ImmunoResearch | 009-000-008 | |
F(ab')2 fragment of goat anti-human Ig (IgG+IgM+IgA) | Jackson ImmunoResearch | 109-006-127 | |
Goat anti-human IgG-alkaline phosphatase, Fcγ fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 109-055-008 | |
Goat anti-human IgM-alkaline phosphatase, Fcµ fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 109-055-095 | |
Goat anti-human IgG-peroxidase, Fcγ fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 109-035-008 | |
Goat anti-human IgM-peroxidase, Fcµ fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 109-035-095 | |
BD ELISPOT AEC substrate kit | BD Biosciences | 551951 | |
C.T.L. ImmunoSpot analyzer | C.T.L. |